蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的作用機(jī)制：基于UHPLC-TOF-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

張春艷，顏羽昕，高曉陽(yáng)，馬月宏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特010059

蒙藥七味清肝散又稱額力根-7，由藍(lán)盆花、紅花、香青蘭、人工牛黃、瞿麥、石膏、五靈脂七味藥材組成，其中起主要作用的為藍(lán)盆花。藍(lán)盆花蒙藥名“陶森-陶日莫”又稱“蒙古山蘿卜花”，具有“燥協(xié)日烏素”、清肝熱、止痛的功效［8,10］；紅花蒙藥名“亢港烏拉干”、“弓谷瑪”［11］，具有保肝、調(diào)血脂、抗炎、陣痛、抗衰老的作用［12,13］；香青蘭蒙藥名“畢日陽(yáng)谷”［14］，具有清胃熱、瀉肝火、止痛、止血、“燥協(xié)日烏素”的作用［15］；人工牛黃具有抗炎、抗氧化、清熱解毒、利膽保肝的功效［16］；瞿麥蒙藥名“高優(yōu)-巴沙嘎”，在抗肝病毒、興奮子宮平滑肌、擴(kuò)張血管上具有重要作用［17,18］；石膏蒙藥名“道竹岡”，具有瀉火、止渴、止痛、抗病毒的作用［19］；五靈脂蒙藥名“巴日格順”，具有活血化瘀、調(diào)節(jié)三根、抗?jié)?、清肝熱、清胃熱、“燥協(xié)日烏素”的作用［20］。

蒙藥七味清肝散在蒙醫(yī)實(shí)踐中具有很好的抗肝纖維化作用，但具體機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)一步闡明蒙藥七味清肝散抗肝纖維化作用的藥效成分和作用機(jī)制對(duì)肝纖維化的防治具有重要意義。目前大多數(shù)治療肝纖維化的方法是突出對(duì)一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)信號(hào)分子的作用，沒有考慮到肝纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過程［21］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)把系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，融合在一起，通過多層次闡明藥物的作用機(jī)制，具有整體性，系統(tǒng)性的特點(diǎn)［22］。本文利用UHPLC-TOF-MS方法對(duì)蒙藥七味清肝散的成分進(jìn)行鑒定，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法尋找多通路、多靶點(diǎn)，通過分子對(duì)接、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的作用機(jī)制和其準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料

UHPLC-TOF-MS(島津高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀器)、BT125Dd分析天平（（Saryorius），KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Microfuge22R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter）、M16710-33漩渦振蕩器（Thermo Scientific）、蒙藥七味清肝散（內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)責(zé)任有限公司），醋酸銨、甲酸、甲醇、超純水；Masson三色染色試劑盒（索萊寶）；RIPA裂解液（索萊寶）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（索萊寶）、5×蛋白上樣緩沖液（索萊寶）、、兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（博奧森）；兔抗大鼠I型膠原蛋白（Collagen1）抗體（博奧森）；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（博奧森）；兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體（博奧森）；兔抗大鼠蛋白激酶B（Akt）抗體（博奧森）；Dylight 800標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（Abbkine）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天）、10%胎牛血清（Gibco）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)成分鑒定 稱取蒙藥七味清肝散0.3 g樣品于15 mL離心管中，加入5 mL 50%甲醇浸泡4 h，40 ℃超聲提取40 min，4 ℃，12 000 r/min下離心10 min，取上清液放于25 mL容量瓶，重復(fù)操作1次，將兩次上清液合并到一起，搖勻，取10 μL 上清進(jìn)液相檢測(cè)。在含有0.1%甲酸，0.2 mol/L醋酸銨溶液-乙腈質(zhì)譜條件下進(jìn)行梯度洗脫。將UHPLC-TOF-MS的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MSDLAL4.12軟件進(jìn)行預(yù)處理，其中主要包括提取、去噪音、反卷積、峰對(duì)齊等重要步驟，最后導(dǎo)出CSV格式。將提取的峰信息在MassBank，Respect，GNPS三個(gè)庫(kù)進(jìn)行全庫(kù)檢索和對(duì)比，從而得出可能的分子式。

1.2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集 在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索成分的結(jié)構(gòu)，并在chemDrawV14.00.117軟件中轉(zhuǎn)化成Canonical SMILES結(jié)構(gòu)，在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）篩選相關(guān)性≥70%作為蒙藥七味清肝散相關(guān)靶點(diǎn)；在治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選相關(guān)性≥60%作為肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。蒙藥七味清肝散相關(guān)靶點(diǎn)和肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)取交集后得到蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING（https://www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得PPI互作信息，再將信息導(dǎo)入到Cytoscape3.6.0軟件，應(yīng)用Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲笜?biāo)分析，篩選抗肝纖維化的核心靶點(diǎn)。為了清晰分析相關(guān)指標(biāo)，將蒙藥七味清肝散的活性成分、靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入到Cytoscape3.6.0構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

端村排閘，孔深15m。閘基高程6.9～7.9m為第②層壤土，構(gòu)成地基直接持力層，具中等壓縮性，微透水性，穩(wěn)定性較好。高程6.9～5m為②2層砂壤土，具中等壓縮性，中等透水性，滲透穩(wěn)定性較差，具有液化潛勢(shì)。高程5～-1.1m為第③3層粉砂、③4層細(xì)砂，飽和，中密，中等透水性，滲透穩(wěn)定性較差，具液化潛勢(shì)。

1.2.4 GO與KEGG富集分析 將蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)上傳到Metascape 平臺(tái)中篩選排名靠前的GO 和KEGG 關(guān)鍵信息，在微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG富集分析可視化。

1.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 在PDB（http://www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載肝纖維化核心靶點(diǎn)，運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，除去小分子和配體，保存為PDB格式。在Open Babel2.4.1軟件獲取蒙藥七味清肝散活性成分的2D結(jié)構(gòu)，將其保存為mol2格式，最后運(yùn)用AutoDock平臺(tái)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。一般分子與靶點(diǎn)結(jié)合能低于0時(shí)，說明活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性高，抗肝纖維化作用越強(qiáng)。

1.2.6 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，7周，分為空白、HF模型組、蒙藥七味清肝散低、中、高劑量組[135、270、405/（kg·d）]；本藥成人臨床劑量為1.5～3.0 g/d，每個(gè)給藥組劑量按照種屬間劑量折算表進(jìn)行，并按照成人劑量的1、2、3倍計(jì)算。進(jìn)行給藥。除空白組，其他組用2 mL/kg的50%四氯化碳花生油溶液灌胃，2次/周，10周，在造模的過程中，空白組和模型組均采用0.5%CMC-Na灌胃，對(duì)給藥組進(jìn)行灌胃，10周后取肝臟組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.1 肝組織的病理學(xué)觀察 取適量肝組織放在盛有4%甲醛的容器中固定48 h，把肝組織放入70%、80%、90%的梯度酒精及無水乙醇中進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片后用Masson三色染色，并在顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)。

1.2.6.2 Western blotting檢測(cè)α-SMA、Collagen1、PI3K、Akt蛋白表達(dá) 將肝組織剪碎后加入PMSF，數(shù)分鐘后加入RIPA，使其充分裂解并在12 000 r/min 下離心10 min，上清液測(cè)蛋白濃度后按照1：4加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，在-80℃冰箱中保存。通過電泳、轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗室溫2 h孵育，TBST洗滌3次，10 min/次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，進(jìn)行顯色。

1.2.7 離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 Wistar大鼠20只、雄性、體質(zhì)量150～170 g，分為空白組10只和七味清肝散給藥10只組進(jìn)行給藥。將蒙藥七味清肝散按照成人最低劑量10倍折算后的給藥劑量為1350 mg/（kg/d），1次/d，第7天灌胃前12 h禁食，灌胃后在2 h內(nèi)麻醉，采用負(fù)壓血樣采集容器進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，靜止20 min，在3000 r/min下離心15 min，離心后得上清液在56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μmol濾膜過濾后得含藥血清，保存于-80 ℃冰箱中。空白組用生理鹽水灌胃，操作方法同前。

1.2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HSC-T6細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，溫度為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.7.2 蒙藥七味清肝散含藥血清對(duì)HSC-T6凋亡的影響 設(shè)置無染色孔、單染孔、對(duì)照組、蒙藥七味清肝散含藥血清低、中、高劑量組，每組5個(gè)復(fù)孔。將HSC-T6貼壁培養(yǎng)12 h后，各組加入相應(yīng)濃度（10%、15%、20%）的含藥血清連續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞消化下來12 000 r/min離心5 min，棄掉上清液后加入AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC混勻，加入PI混勻。室溫孵育20min后進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，大于兩組比較采用單因素方式差分析，組間兩兩比較具有正態(tài)性和方差齊性后采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分鑒定

根據(jù)總離子流圖、一級(jí)和二級(jí)碎片信息得到化合物準(zhǔn)確分子量。通過保留時(shí)間、質(zhì)荷比、加合離子等鑒定出蒙藥七味清肝散的化學(xué)成分。共鑒定出45個(gè)化合物，包括黃酮類、生物堿、香豆素、萜類、酚類、脂肪酸等（表1）。

表1 蒙藥七味清肝散化學(xué)成分的UHPLC-TOF-MS鑒定Tab.1 Identification of chemical constituents of the Mongolian medicine Qiwei Qinggan Powder by UHPLC-TOF-MS

2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集

將化學(xué)成分的Canonical SMILES 號(hào)輸入Swiss Target Prediction選擇物種為“Homo sapiens”，選取相關(guān)性≥70%作為蒙藥七味清肝散化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)共159個(gè)，在GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)輸入“Hepatic Fibrosis”選取相關(guān)性≥60%作為肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)共1852個(gè)。通過Venny.2.1.0網(wǎng)站獲得蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)62個(gè)（圖1）。

圖1 成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn plots of composition-related targets and disease-related targets.

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選取“Multiple Proteins”模式，限定物種為“Homo sapiens”，置信度為0.9，得到PPI 互作信息。圖中共有節(jié)點(diǎn)62個(gè)，133條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.29（圖2）?！肮?jié)點(diǎn)”代表靶點(diǎn)，“邊”代表靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系，“combine score”代表邊的粗細(xì)，combine score值越大，代表其結(jié)合度越強(qiáng)。

圖2 蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of Qiwei Qinggan Power against liver fibrosis.

2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將蒙藥七味清肝散的活性成分、靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入到Cytoscape3.6.0 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖3）。采用Network Analyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，其中綠色代表靶點(diǎn)、紅色代表活性成分、紫色代表通路。節(jié)點(diǎn)的大小由Degree值決定，由拓?fù)洚悩?gòu)分析篩選節(jié)點(diǎn)緊密度（compactness）≥中位數(shù)3.1，Degree值≥2倍中位數(shù)8，節(jié)點(diǎn)中介中心性（Mediation centrality）≥中位數(shù)0.009，篩選出Akt1、PIK3R1、MAPK1、GSK3B、EGFR等10個(gè)核心靶點(diǎn)（表3）。根據(jù)Degree 值排序發(fā)現(xiàn)Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Apigenin、Naringenin、Retinoic acid、Palmitic acid等活性相對(duì)較高。

圖3 蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The"Active Ingredients-Targets-Pathways"network of Qiwei Qinggan Power against liver fibrosis.

表2 蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的核心靶點(diǎn)Tab.2 Core targets of Qiwei Qinggan Power against liver fibrosis

表3 蒙藥七味清肝散活性成分參數(shù)Tab.3 Active ingredient parameters of Qiwei Qinggan Power

2.5 GO功能分析

將蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)，進(jìn)行GO注釋分析，研究背景為“Homo sapiens”選擇生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF），并對(duì)每個(gè)組排名靠前的信息在微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化分析（圖4）。BP主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路。CC主要涉及膜微域組分、胞質(zhì)囊腔、基質(zhì)膜等組分。MF主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、核受體的活動(dòng)、跨膜受體蛋白激酶活性等。

圖4 BP、CC、MF生物功能富集Fig.4 Enrichment analysis of biological functions in terms of biological process (A),cell components (B),and molecular function(C).

2.6 KEGG通路分析

將蒙藥七味清肝散抗肝纖維化靶點(diǎn)在Metascape平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路（P＜0.05）。將排名靠前的20個(gè)通路在微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化分析（圖5），“縱坐標(biāo)”代表信號(hào)通路名稱，“氣泡大小”代表基因的富集數(shù)目。這些通路主要涉及疾病信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、炎癥相關(guān)通路。例如，PI3K/Akt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路都是典型的肝纖維化相關(guān)通路。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis.

2.7 分子對(duì)接

選取Degree 值排名靠前的3 個(gè)活性成分Quercetin、Luteolin、Kaempferol再選取Degree值排名靠前的3個(gè)靶點(diǎn)Akt1、PIK3R1、MAPK1進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。由對(duì)接結(jié)果可知（表5），Quercetin分別與Akt1、PIK3R1、MAPK1具有很好的結(jié)合性；Luteolin分別與Akt1、PIK3R1、MAPK1具有很好的結(jié)合性；Kaempferol分別與Akt1、PIK3R1、MAPK1具有很好的結(jié)合性。

表4 蒙藥七味清肝散抗肝纖維化信號(hào)通路Tab.4 Signaling pathways involved in the therapeutic mechanism of Qiwei Qinggan Powder against liver fibrosis

表5 活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Tab.5 Docking results of active ingredients and core targets

2.8 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.8.1 肝組織病理學(xué)觀察 通過Masson染色觀察到空白組無纖維增生，模型組有大量膠原沉積，出現(xiàn)纖維增生。與模型組對(duì)比蒙藥七味清肝散各治療組病理改變有所恢復(fù)（圖6）。

圖6 蒙藥七味清肝散對(duì)小鼠肝臟病理改變的影響Fig.6 Effect of Mongolian medicine Qiwei Qinggan Powder on pathological changes of liver in mice (Masson staining,original magnification:×200).A:Blank group.B:Model group.C:Low-dose group.D:Medium-dose group;E:High-dose group.

2.8.2 Western blotting 檢測(cè)α-SMA、Collagen1、PI3K、Akt蛋白表達(dá) 根據(jù)KEGG通路富集和篩選出的核心靶點(diǎn)，對(duì)肝纖維化密切相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)通路中的PI3K和Akt蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)α-SMA和Collagen1進(jìn)行驗(yàn)證，兩者是大鼠肝纖維化的顯著標(biāo)志。與空白組比較，模型組肝組織中α-SMA（P＜0.01）和Collagen1（P＜0.01）蛋白表達(dá)量升高；與模型組比較，α-SMA在低、中（P＜0.001）、高（P＜0.001）劑量組表達(dá)量均明顯下降，Collagen1在低（P＜0.05）、中（P＜0.001）、高（P＜0.01）劑量組表達(dá)量均明顯下降（圖7）。

圖7 不同劑量蒙藥七味清肝散對(duì)肝組織中α-SMA和Collagen1表達(dá)的影響Fig.7 Effect of different doses of Qiwei Qinggan Powder on liver tissue α-SMA and collagen1 expression.A-C:Levels of α-SMA,Collagen1 were measured by western blotting and quantitatively analyzed(n=3/group).##P＜0.01vs Blank group;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Model group.

與空白組比較，模型組肝組織中PI3K（P＜0.001）、Akt（P＜0.01）蛋白表達(dá)量明顯升高；與模型組比較，PI3K、Akt（P＜0.01）在低劑量組表達(dá)下降，PI3K（P＜0.001）、Akt（P＜0.001）在中劑量組表達(dá)顯著下降，PI3K（P＜0.001）、Akt（P＜0.01）在高劑量組表達(dá)明顯下降（圖8）。

圖8 不同劑量蒙藥七味清肝散對(duì)肝組織中PI3K、Akt表達(dá)的影響Fig.8 Effect of different doses of Qiwei Qinggan Powder on liver tissue PI3K and Akt expression.A-C:Levels of PI3K,Akt were measured by western blotting and quantitatively analyzed(n=3/group).##P＜0.01,###P＜0.001 vs Blank group;**P＜0.01,***P＜0.001 vs Model group.

2.9 離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.9.1 蒙藥七味清肝散含藥血清對(duì)HSC-T6凋亡的影響根據(jù)流式檢測(cè)結(jié)果可知，含藥血清與對(duì)照組比較，蒙藥七味清肝散含藥血清低劑量（P＜0.01）組導(dǎo)致HSC-T6凋亡率增加，蒙藥七味清肝散含藥血清中、高劑量組（P＜0.001）導(dǎo)致HSC-T6凋亡率明顯增加。結(jié)果顯示，蒙藥七味清肝散含藥血清的濃度越高抗肝纖維化作用越明顯（圖9）。

圖9 蒙藥七味清肝散含藥血清對(duì)HSC-T6凋亡的影響Fig.9 Effect of serum from Qiwei Qinggan Power-treated rats on apoptosis of HSC-T6 cells (n=3).A:Control group.B:Low-dose group.C:Medium-dose group.D:High-dose group.E:Apoptotic rate.**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

3 討論

肝纖維化是慢性肝病常見的病理特征，是慢性肝損傷導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的原因之一［23］。各種化學(xué)和微生物因素都是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的誘因［24］，包括酒精、病毒、藥物和自身免疫過程，而肝纖維化一旦發(fā)展成肝硬化將不可逆轉(zhuǎn)［25］。在變成晚期肝硬化或肝癌之前，盡早尋找解決方案［26,27］。在目前的研究中沒有直接減輕或者逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物。

本文采用UHPLC-TOF-MS技術(shù)從蒙藥七味清肝散中鑒定了45個(gè)成分，包括黃酮類、生物堿、香豆素有機(jī)酸、萜類、酚類、脂肪酸等。篩選出25個(gè)活性成分參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、其中排名靠前的Quercetin、Luteolin、Kaempferol等在網(wǎng)絡(luò)中的影響較大并且在抗肝纖維化作用中具有顯著作用。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到10個(gè)蒙藥七味清肝散抗肝纖維化的核心靶點(diǎn)（Akt1、PIK3R1、MAPK1、GSK3β、EGFR、INSR、MAPK14、CYP1B1、IGF1R、SRC）等。通過GO功能分析得出，BP主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路。CC主要涉及膜微域組分、胞質(zhì)囊腔、基質(zhì)膜等組分。MF主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、核受體的活動(dòng)、跨膜受體蛋白激酶活性等。通過富集分析結(jié)果得出，PI3K/Akt、Rap1、MAPK、AMPK、PPAR信號(hào)通路都參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。其中PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的凋亡抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在胃癌［28］、宮頸癌［29］、肝癌［30］等腫瘤的生長(zhǎng)代謝中發(fā)揮重要作用。PI3K被激活后可以激活下游Akt蛋白，Akt調(diào)節(jié)下游的凋亡基因，從而使凋亡基因失活，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的［31］。結(jié)合圖3活性成分-靶點(diǎn)-通路分析，在PI3K 通路中涉及到6 種關(guān)鍵活性成分（Apigenin-7-O-glucoside、Quercetin、Apigenin、Luteolin、Kaempferol、L-(+)-arginine）和15 個(gè)關(guān)鍵靶蛋白（Akt1、CDK6、EGFR、FLT3、GSK3β、IGF 1R、IL2、NSR、KDR、MET、NOS3、PIK3R1、MAPK1、PTK2、RXRA）。這些關(guān)鍵的靶蛋白主要參與物質(zhì)代謝、細(xì)胞凋零和炎癥等。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，Quercetin、Luteolin、Kaempferol分別與Akt1、PIK3R1、MAPK1具有很好的結(jié)合能。在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，通過Masson染色結(jié)果顯示，蒙藥七味清肝散減少肝細(xì)胞變性、肝細(xì)胞壞死、減少假小葉的形成，使纖維化的肝臟組織得到改善。同時(shí)，Western blotting結(jié)果顯示，蒙藥七味清肝散在體內(nèi)能夠減少α-SMA 和Collagen1 的蛋白表達(dá)量，能夠降低PI3K/Akt通路中PI3K、Akt蛋白的表達(dá)。證實(shí)了蒙藥七味清肝散是通過作用于關(guān)鍵通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝纖維化作用。在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過流式檢測(cè)得出蒙藥七味清肝散含藥血清能夠促進(jìn)HSC-T6的凋亡率增加，在規(guī)定的范圍內(nèi)濃度越高HSC-T6凋亡率越高抗肝纖維化作用越明顯。

綜上分析，蒙藥七味清肝散可以使纖維化的組織恢復(fù)正常。通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)起到抗肝纖維化的作用。七味清肝散的含藥血清隨著濃度的升高可以明顯促HSC-T6 的凋亡。本研究采用UHPLC-TOF-MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法對(duì)蒙藥七味清肝散抗肝纖維化作用機(jī)制進(jìn)行了研究，證實(shí)了蒙藥七味清肝散通過調(diào)控重要靶點(diǎn)，從整體協(xié)同發(fā)揮抗肝纖維化的作用。