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    新輔助同步放化療對(duì)直腸癌微環(huán)境浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的影響

    2021-09-10 03:01:32周春香蔣玉娜李鎮(zhèn)江馬進(jìn)安
    關(guān)鍵詞:單抗陽(yáng)性率直腸癌

    楊 群,周春香,韓 宸,張 穎,蔣玉娜,李鎮(zhèn)江,馬進(jìn)安

    中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院1臨床護(hù)理學(xué)教研室,2腫瘤科,3胃腸外科,湖南 長(zhǎng)沙410011

    我國(guó)2018 年癌癥報(bào)告顯示,結(jié)直腸癌發(fā)病率居第3位,死亡率居第5位,且直腸癌發(fā)病率略高于結(jié)腸癌。直腸癌由于其特殊的解剖結(jié)構(gòu)和位置,手術(shù)切除時(shí)技術(shù)難度大于結(jié)腸癌,其復(fù)發(fā)率也明顯高于結(jié)腸癌,術(shù)后5年生存率為50%左右[1]。術(shù)前新輔助同步放化療(CRT)是局部晚期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略,20%~30%患者達(dá)到臨床完全緩解[2],有5%~44%患者可達(dá)到病理完全緩解[3-5]。研究表明新輔助CRT后達(dá)到臨床完全緩解的患者,觀察-等待策略的生存數(shù)據(jù)不劣于根治性手術(shù)方案,觀察等待組和手術(shù)組的3 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率(88%vs78%)和總生存率(96%vs87%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[6]。直腸癌“新輔助CRT-觀察-等待”的保肛策略越來(lái)越受到患者和醫(yī)生的重視,但目前新輔助CRT的臨床完全緩解率僅30%左右,限制了絕大部分直腸癌患者的這種臨床選擇。如何提高直腸癌新輔助CRT的完全緩解率是臨床實(shí)施保肛策略急需解決的難題,免疫治療聯(lián)合新輔助CRT也許是一個(gè)很好的策略。

    腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型可在一定水平上預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1單抗免疫治療的療效,富集免疫細(xì)胞的“熱腫瘤”對(duì)免疫治療更為有效[7,8]。放療可以誘發(fā)腫瘤遠(yuǎn)隔效應(yīng)說(shuō)明其具有一定的免疫激活作用[7],但放療對(duì)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的影響一直存在爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),還可以抑制淋巴細(xì)胞,削弱抗腫瘤免疫[9,10]。也有研究表明放療可以增加腫瘤局部浸潤(rùn)免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)免疫,腫瘤局部預(yù)先存在浸潤(rùn)免疫細(xì)胞也是免疫檢控點(diǎn)抑制劑起效的前提[11]。大部分實(shí)體瘤內(nèi)缺乏浸潤(rùn)免疫細(xì)胞,微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài),對(duì)PD-1/PD-L1單抗反應(yīng)性欠佳,放療可能是一個(gè)潛在的激發(fā)啟動(dòng)策略[7,8]?;熞部烧T導(dǎo)腫瘤局部CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn),下調(diào)Treg細(xì)胞等抑制性免疫細(xì)胞[12,13]。理論上同步放化療腫瘤殺滅能力增強(qiáng),但新輔助CRT前后直腸癌微環(huán)境中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型如何變化目前尚不明確。本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)直腸癌新輔助CRT前后活檢與手術(shù)標(biāo)本組織中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(CD3、CD4、CD8、CD56、Foxp3)的數(shù)量和表型變化,前后自身對(duì)照比較分析新輔助CRT 對(duì)直腸癌免疫微環(huán)境的影響,以期為臨床聯(lián)合免疫治療增效直腸癌新輔助CRT提供理論基礎(chǔ)。

    1 資料和方法

    1.1 一般資料

    本研究共納入2016年1月~2018年12月于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院確診,新輔助CRT后接受直腸癌根治術(shù)的臨床Ⅱ~Ⅲ期直腸癌患者20例。所有患者的術(shù)前活檢與術(shù)后石蠟包埋組織標(biāo)本均在病理科存檔,排除術(shù)后病理完全緩解患者,均有完善的臨床病理資料及隨訪資料,隨訪截止至2019年12月,詳細(xì)臨床資料見(jiàn)表1。其中男性15例,女性5例;年齡39~68歲,平均年齡52.9±8.5歲,中位年齡51歲;病理診斷均為直腸腺癌;病理組織學(xué)分級(jí):高分化(G1)7 例(35%),中分化(G2)3 例(15%),低分化(G3)10例(50%);臨床TMN分期:Ⅲ期17例(85%),Ⅱ期3例(15%);放療模式:總劑量50 Gy/2.0 Gy/25F,所有患者均使用卡培他濱片(825 mg/m2,口服,2 次/d)同步化療;16 例(80%)患者在新輔助CRT 前接受至少1 周期XELOX 方案化療(奧沙利鉑130 mg/m2,靜脈滴注,d1+卡培他濱片1000 mg/m2,口服,2次/d,d1-d14,21 d重復(fù));完成新輔助CRT與手術(shù)的間隔時(shí)間為43.5±17.6 d,中位數(shù)為38.5 d;新輔助CRT后腫瘤縮退分級(jí)(TRG)0級(jí)患者0例,TRG 1級(jí)患者4例(20%),TRG 2級(jí)患者6例(30%),TRG 3級(jí)患者10例(50%);其中17例患者為微衛(wèi)星穩(wěn)定型,3例患者為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定型;隨訪截止時(shí)有6例患者(30%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期為14~44月,理論中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期為26.5月。

    1.2 試劑

    兔單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD56及鼠單克隆抗體FoxP3均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;ElivisionTM Plus二抗試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    所有直腸癌組織標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋,5 μm厚連續(xù)石蠟常規(guī)切片脫蠟水化,抗原修復(fù),內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活,行免疫組織化學(xué)染色,具體操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)采用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,采用PBS液替代相應(yīng)一抗為空白對(duì)照。

    1.4 結(jié)果判定

    CD3、CD4、CD8、CD56主要以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性,F(xiàn)oxP3陽(yáng)性則主要為細(xì)胞漿著色。先于低倍鏡下觀察著色細(xì)胞的均勻性,然后隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200),計(jì)算標(biāo)本的染色強(qiáng)度,未見(jiàn)染色記0分、淡黃色記1分、黃色記2分、棕褐色記3分。利用Image J軟件分別計(jì)算出每個(gè)視野中可見(jiàn)的所有細(xì)胞面積和免疫組化染色呈陽(yáng)性細(xì)胞的面積,以染色陽(yáng)性細(xì)胞面積/視野中所有細(xì)胞面積=陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比,取5個(gè)視野的平均值為免疫組化染色的平均陽(yáng)性率[14],0%~5%為0 分,6%~25%為1 分,26%~75%為2分,>75%為3分,染色強(qiáng)度、平均陽(yáng)性率二者得分相乘得出總分,0~3分為低表達(dá),4~9分為高表達(dá)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,服從正態(tài)分布的配對(duì)樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),不服從正態(tài)分布的配對(duì)樣本均數(shù)的比較采用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)。變量之間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析以及Spearman 相關(guān)性分析,多因素分析采用COX回歸模型。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 新輔助CRT前后CD3的表達(dá)情況

    直腸癌新輔助CRT后CD3的平均陽(yáng)性率較前顯著增高[(21.8%±10.5%)vs(48.8%±16.3%)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖1)。15例(75%)患者新輔助CRT后CD3陽(yáng)性率較前升高。

    圖1 新輔助CRT前后CD3表達(dá)的變化Fig.1 Changes of CD3 expression before and after neoadjuvant CRT(P<0.001).

    2.2 新輔助CRT前后CD4的表達(dá)情況

    直腸癌新輔助CRT后CD4平均陽(yáng)性率較前顯著增高[(16.5±8.7)%vs(42.2±12.6)%],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2)。18例(90%)患者CD4陽(yáng)性率較前升高。

    圖2 新輔助CRT前后CD4表達(dá)的變化Fig.2 Changes of CD4 expression before and after neoadjuvant CRT(P<0.001).

    2.3 新輔助CRT前后CD8的表達(dá)情況

    直腸癌新輔助CRT后CD8平均陽(yáng)性率較前顯著升高[(8.3±6.8)%vs(33.4±20.7)%],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖3)。15 例(75%)患者新輔助CRT 后CD8陽(yáng)性率較前升高。CD4/CD8平均比值在新輔助CRT 后較前升高[(2.7±2.3)%vs(5.1±12.8)%],但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)。

    圖3 新輔助CRT前后CD8表達(dá)的變化Fig.3 Changes of CD8 expression before and after neoadjuvant CRT(P<0.001).

    2.4 新輔助CRT前后CD56的表達(dá)情況

    直腸癌新輔助CRT 后腫瘤組織中CD56 的平均陽(yáng)性率較前明顯升高[0vs(7.6±12.1)%],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012,圖4)。所有患者新輔助CRT前CD56陽(yáng)性率為0,6例(30%)患者新輔助CRT后CD56陽(yáng)性率升高。

    圖4 新輔助CRT前后CD56表達(dá)的變化Fig.4 Changes of CD56 expression before and after neoadjuvant CRT(P=0.012).

    2.5 新輔助CRT前后Foxp3的表達(dá)情況

    直腸癌新輔助CRT后腫瘤組織中Foxp3平均陽(yáng)性率較前顯著下降[(26.0±21.5)vs(15.3±21.8)%],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005,圖5)。13例(65%)患者新輔助CRT后Foxp3陽(yáng)性率下降。

    圖5 新輔助CRT前后Foxp3表達(dá)的變化Fig.5 Changes of Foxp3 expression before and after neoadjuvant CRT(P=0.005).

    2.6 新輔助CRT前后免疫標(biāo)記物的變化與患者臨床病理因素的相關(guān)性

    新輔助CRT前后CD3和CD8表達(dá)升高的患者有著更長(zhǎng)的無(wú)復(fù)發(fā)生存期,但CD4、CD56、Foxp3的表達(dá)變化與患者臨床病理因素?zé)o顯著相關(guān)性(表2、圖6)。

    圖6 CD3、CD8的變化與DFS的相關(guān)性Fig.6 Correlation of changes of CD3-(P=0.028) and CD8-positive cells (P=0.001) with disease-free survival of the patients,

    表2 新輔助CRT前后免疫標(biāo)記物的變化與DFS的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the changes of immune markers and disease-free survival before and after neoadjuvant CRT

    3 討論

    腫瘤組織中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞不僅作用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而且可以對(duì)腫瘤的治療反應(yīng)和預(yù)后產(chǎn)生影響。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)直腸癌患者和健康人大腸組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中浸潤(rùn)的T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量少于健康人,而腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量則大于健康人[15]。CD3主要表達(dá)在成熟T細(xì)胞表面,某種程度上反應(yīng)T細(xì)胞的整體水平。CD4主要表達(dá)在輔助T細(xì)胞表面,CD4+T細(xì)胞主要在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起免疫監(jiān)視作用,可通過(guò)釋放溶細(xì)胞酶直接殺傷腫瘤細(xì)胞,也能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、增強(qiáng)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活性間接殺傷腫瘤細(xì)胞[16,17]。CD8主要表達(dá)在細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面,在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中起主要?dú)饔?。在炎癥因子的趨化下,CD8+T細(xì)胞向腫瘤局部聚集,對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和殺傷。

    本研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT可以對(duì)直腸癌微環(huán)境浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型產(chǎn)生明顯影響,增加術(shù)后直腸癌組織中CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。盡管本研究的樣本量偏少,但采用直腸癌新輔助CRT前后的活檢標(biāo)本、術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行自身對(duì)照,所以得到的CRT對(duì)直腸癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞影響的結(jié)果比較直接可靠,有一定臨床意義。Ogura等18]研究了新輔助CRT前后直腸癌腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的變化,發(fā)現(xiàn)新輔助CRT后CD8+T細(xì)胞較治療前明顯升高。新輔助CRT通過(guò)殺滅腫瘤細(xì)胞,可增加腫瘤新抗原的表達(dá)與釋放,從而促進(jìn)炎癥趨化因子募集免疫細(xì)胞來(lái)激活直腸癌局部的免疫效應(yīng)。

    本研究發(fā)現(xiàn)CD3+T、CD8+T細(xì)胞的增加與患者預(yù)后呈正相關(guān),說(shuō)明CD3+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的變化可以作為評(píng)估直腸癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。薈萃分析證實(shí)頭頸部鱗癌中CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)預(yù)示良好的預(yù)后[19]。腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量被認(rèn)為可以預(yù)測(cè)直腸癌[20]、肛門(mén)癌[21]的預(yù)后。但CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)密度對(duì)腫瘤預(yù)后的影響與癌種相關(guān),CD4+T 細(xì)胞在肺癌[22]、乳腺癌[23]中與預(yù)后不良相關(guān),而在大腸癌患者中卻是預(yù)后良好的因素[24],造成這種差異的原因可能是CD4+T細(xì)胞在不同腫瘤類(lèi)型的免疫微環(huán)境中有著不同的功能。

    NKT細(xì)胞兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特性,可以通過(guò)分泌溶細(xì)胞酶和細(xì)胞毒性因子并且以非MHC限制的方式殺傷腫瘤細(xì)胞[25]。胃癌、肺癌中高密度的NKT細(xì)胞浸潤(rùn)已被證實(shí)與患者的生存改善有關(guān)[26,27]。本研究新輔助CRT前腫瘤組織中CD56的表達(dá)均為陰性,提示NKT細(xì)胞在直腸癌組織中低表達(dá)。既往大樣本結(jié)直腸癌腫瘤組織中,僅9%的患者發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性NKT細(xì)胞[28],說(shuō)明NKT細(xì)胞在結(jié)直腸癌組織中的浸潤(rùn)存在障礙。我們的研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT后,直腸癌組織中CD56的表達(dá)顯著升高,表明CRT可以導(dǎo)致NKT細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)增加。

    Foxp3作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子參與Treg細(xì)胞的分化與功能行使。Foxp3+Treg細(xì)胞被認(rèn)為能抑制抗腫瘤免疫,腫瘤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)往往提示預(yù)后不良[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT能夠顯著降低直腸癌組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量,說(shuō)明CRT可以通過(guò)抑制Treg細(xì)胞表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的抑制狀態(tài)。

    具有放療史的非小細(xì)胞肺癌患者接受PD-1單抗治療,其療效是無(wú)放療史人群的2倍[32],化療聯(lián)合PD-1單抗也能大幅提高其有效率[33],證實(shí)肺癌中放療、化療對(duì)PD-1單抗免疫治療具有增效作用。本研究結(jié)果顯示同步放化療可以誘導(dǎo)直腸癌局部微環(huán)境中免疫細(xì)胞的募集,增加腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞水平,可以讓直腸癌轉(zhuǎn)化成“熱腫瘤”。因此,PD-1/PD-L1 單抗免疫治療在理論上支持增效直腸癌新輔助CRT,值得臨床進(jìn)一步探索。

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