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    川芎嗪羥丙基-β-環(huán)糊精包合物柔性脂質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)研究

    2021-09-10 08:09:26付麗娜李偉澤楊黎彬
    西北藥學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)水包合物脂質(zhì)體

    付麗娜,李偉澤,趙 寧,樊 琨,李 健,楊黎彬

    (西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,西安 710021)

    柔性脂質(zhì)體(FL)是一種極具潛力的微粒型給藥載體[1-2],是一種良好的抗腫瘤藥物的載體。本課題組前期實驗結(jié)果表明,以丙二醇為柔軟劑制備的FL包封率、穩(wěn)定性和吸收率均較好[3]。因此,將川芎嗪(LI)制備成川芎嗪柔性脂質(zhì)體(LIFL),有利于提高LI的穩(wěn)定性和治療指數(shù)[4]。但其藥物泄漏率較高,主要是因為丙二醇是一種水性柔軟劑,包載入脂質(zhì)雙分子層后增加了其疏水性,降低了磷脂雙分子層的屏障作用導(dǎo)致其不穩(wěn)定。

    羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)具有內(nèi)疏水[5-7]、外親水的特殊結(jié)構(gòu),可使難溶性藥物通過置換作用進(jìn)入到內(nèi)腔形成包合物,是一種唯一可供注射用的包合物制備材料,在常溫下具有良好的水溶性,在體內(nèi)基本不會累積,且包合于其內(nèi)部的藥物在體內(nèi)可迅速釋放[8-9]。

    本課題組以HP-β-CD為包合物包合LI得到HCD-LI,并以此為內(nèi)水相藥物制備其納米柔性脂質(zhì)體(HCD-LIFL),以解決液態(tài)LIFL泄漏率較高、穩(wěn)定性不足的問題,對FL的進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);差示掃描量熱儀(DSC,Stare系統(tǒng),瑞士Mettler-Toledo公司);ZEN-3600型激光粒度儀(英國Malvern Zetamaster公司);1-14sartorius型離心機(jī)和Quintix224-1 Cnsartorius型電子天平,均購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;H11-1型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司);DHG9140B型電鼓風(fēng)干燥箱(上海安亭科學(xué)儀器廠);FJ-200型高速分散勻質(zhì)機(jī)和SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵,均購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

    1.2試藥 川芎嗪對照品(LI,中國藥品生物制品檢定所,批號110817-201903);鹽酸川芎嗪(上海太偉藥業(yè)有限公司,批號180212);注射用大豆卵磷脂(上海山浦化工有限公司,批號201281009);膽固醇(安徽科寶生物科技有限公司,批號171013);羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號20180317);1,2-丙二醇(天津大茂化學(xué)試劑廠,批號20190203);硫酸魚精蛋白(北京悅康凱悅制藥有限公司,批號YY180502);TritonX-100 (國藥集團(tuán)滬試,批號20181121);其余試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1測定方法的建立

    2.1.1色譜條件 采用HPLC法測定LI的質(zhì)量濃度,色譜柱:ZorbaxEcLIpseXDB-C18(150 mm×2.1 mm,0.45 μm),流動相:水-甲醇=40∶60,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量:20 μL,檢測波長:295 nm。

    2.1.2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取LI對照品10.00 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋定容,配成質(zhì)量濃度分別為10、25、50、75、100、125 μg·mL-1的LI對照品溶液,精密移取上述各溶液20 μL,注入高效液相色譜儀,以LI的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:y=46.04x-364.95,R2=0.999 3。結(jié)果顯示,LI質(zhì)量濃度在10~125 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.1.3方法學(xué)考察 精密度考察:分別精密量取2.1.2項下制備的質(zhì)量濃度為10、25、75 μg·mL-1的LI對照品溶液各20 μL,按照2.1.1項下色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣 6次,測定峰面積,測得RSD值分別為0.87%、0.29%、0.05%,表明儀器精密度良好。

    穩(wěn)定性考察:按照2.1.2項下方法配制質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的LI對照品溶液,于室溫下放置,在0、1、3、6、8、12、24 h分別取20 μL,按照 2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣檢測,測得RSD值為0.21%(n=3),表明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    回收率實驗:精密吸取空白脂質(zhì)體1.0 mL,分別加入2.1.2項下制備的低、中、高3個質(zhì)量濃度(10、75、125 μg·mL-1)的LI對照品溶液,混勻后,精密吸取 20 μL注入高效液相色譜儀,按照2.1.1項下色譜條件測定,通過對照品測得量與加入量之比計算回收率。結(jié)果平均回收率分別為102.90%、99.14%、101.72%(n=3),RSD值均小于2.00%。

    2.2HCD-LI的制備及考察

    2.2.1HCD-LI的制備 精密稱取鹽酸川芎嗪2.00 g,加水溶解后加0.1 mol·L-1的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至10,待析出白色LI結(jié)晶,減壓抽濾,干燥得LI。測得其回收率為(98.94%±0.24%) (n=5)。

    精密稱取HP-β-CD,加水10 mL使溶解,得質(zhì)量濃度為200、250、300、350、400 mg·mL-1的HP-β-CD溶液。分別精密稱取5份0.24 g LI,分別置于100 mL燒杯中,加無水乙醇2 mL使溶解,在輸入功率200 W、頻率40 kHz條件下將上述不同質(zhì)量濃度的HP-β-CD溶液緩慢注入LI的乙醇溶液中,常溫超聲60 min。4 ℃避光靜置24 h,待未包合的LI析出,過濾,濾液進(jìn)行冷凍干燥,得到白色粉末。用少量水和無水乙醇洗滌產(chǎn)物,烘干、粉碎后得到包合產(chǎn)物。按公式包合率=(W總-W析)÷W總×100%計算包合率,其中W總為LI的總量,W析為析出的LI,結(jié)果見圖1。

    圖1 HCD-LI包合率 (n=3)

    由圖1可知,隨著HP-β-CD溶液質(zhì)量濃度的增大,可能由于分子之間碰撞的幾率增大,使得反應(yīng)向生成包合物的方向進(jìn)行,包合率隨之增大;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg·mL-1時,HCD-LI對LI的包合率最大,隨后隨HP-β-CD溶液質(zhì)量濃度的增大包合率變化較小。因此,以300 mg·mL-1的HP-β-CD溶液制備HCD-LI。

    2.2.2差示掃描量熱法驗證HCD-LI包合物 用DSC在體積分?jǐn)?shù)為99.99%的氮?dú)夥諊?,加熱速率?0 K·min-1,升溫范圍為0~200 ℃,分別對HP-β-CD粉末(HCD)、LI粉末 (LI)、物理混合物(HCD+LI)、包合物粉末(HCD-LI)進(jìn)行DSC掃描評價,結(jié)果見圖2。

    圖2 HCD-LI包合物差示掃描量熱圖

    由圖2可知,LI在86、180 ℃左右各出現(xiàn)1個熔融峰和1個水峰,因為藥物的熔點在80 ℃左右,且藥物中含有的水分在175 ℃左右蒸發(fā)吸熱。HCD+LI也出現(xiàn)了與LI相同的熔融峰和水峰,基本上是LI和HCD的疊加,而包合物HCD-LI無LI的熔融峰和水峰。說明在本實驗條件下HCD能較好地包合LI,形成穩(wěn)定、良好的包合物。

    2.3LIFL和HCD-LIFL的制備及藥劑學(xué)性質(zhì)研究

    2.3.1制備LIFL和HCD-LIFL 稱取處方量的卵磷脂和膽固醇,置于茄形瓶中,加5 mL無水乙醇使溶解,于50 ℃、-0.05 MPa下濃縮后用無水乙醇復(fù)溶至5 mL,得油相,備用。取純化水38 mL和1,2-丙二醇5 mL混合,得水相;取1/3水相,加入相當(dāng)于0.15 g藥物的HCD-LI置于磁力攪拌器上,在50 ℃以450 r·min-1、氮?dú)夥諊聦⒂拖嗑従徸⑷胨?,水? min,高速均質(zhì)(20 000 r·min-1)5 min,將剩余的水相緩緩加入,同條件下繼續(xù)均質(zhì)5 min;過0.22 μm微孔濾膜,即得HCD-LIFL,4 ℃避光靜置備用。

    將LI加入油相,同法制備LIFL。

    2.3.2LIFL和HCD-LIFL的藥劑學(xué)性質(zhì)考察 包封率考察[10]:分別取LIFL和HCD-LIFL 0.5 mL,置于2 mL離心管中,加入質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液0.5 mL,搖勻,靜置3 min,在室溫條件下,以13 000 r·min-1離心15 min,取沉淀物以4倍量體數(shù)分?jǐn)?shù)為10%TritonX-100甲醇溶液消解至澄清透明。過0.22 μm 針筒過濾器,取20 μL進(jìn)樣測定脂質(zhì)體的包封率。按公式包封率=(W包封÷W總量)×100%計算包封率,其中W包封為被脂質(zhì)體包封的藥量,W總量為實際加入的總藥量。

    結(jié)果顯示,HCD-LIFL對LI的包封率為(69.2%±11.4%)(n=3),是LIFL的1.69倍,表明HCD包裹LI后,內(nèi)水相藥物的包封率增大。這可能是因為脂質(zhì)體內(nèi)水相包裹了LI的包合物后,增加了一層屏障,內(nèi)水相藥物透過脂質(zhì)雙分子層的難度加大,從而增大了藥物的包封率。

    粒徑和電位的測定:取LIFL和HCD-LIFL,以純化水為稀釋劑,按照1∶10的比例稀釋后,采用Malvern激光粒度儀測定HCD-LIFL的粒徑和電位,結(jié)果見圖3。HCD-LIFL和LIFL的粒徑分別為(240.1±4.2)、(191.5±3.5) nm(n=3),二者的多分散性指數(shù)(PDI)均小于0.5,表明其粒徑分布較均勻;其Zeta電位值分別為 (-33.9±2.3)、(-31.6±2.8) mV(n=3)。因此,藥物被包合后存在于內(nèi)水相藥物中,對脂質(zhì)體粒徑和電位幾乎無影響;當(dāng)Zeta電位的絕對值大于30 mV時,脂質(zhì)體微粒間存在的較大靜電斥力將利于微粒給藥體系穩(wěn)定性的提高與粒徑的均勻[11-12],因此制備的HCD-LIFL較穩(wěn)定。

    圖3 HCD-LIFL的粒徑和電位

    2.3.3HCD-LIFL的泄漏率考察 分別量取LIFL和HCD-LIFL各5 mL,置于處理好的透析袋中,兩邊用夾子固定并置于裝有一定體積生理鹽水的燒杯中,置于恒溫磁力攪拌器上(溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速 350 r·min-1)透析至平衡,測定其包封率(E0);透析平衡后,換生理鹽水,再次于4、25、37 ℃避光透析,分別在 0、3、6、9、12、24 h取樣 1 mL,并及時補(bǔ)充等量的生理鹽水,樣品過 0.22 μm針筒濾頭過濾器,用HPLC法檢測LI的質(zhì)量濃度,計算此時的包封率(Ei)。用公式泄漏率=(1-Ei÷E0)×100%[13]計算泄漏率。結(jié)果見圖4。

    圖4 脂質(zhì)體的泄漏率 (n=3)

    脂質(zhì)體不穩(wěn)定造成的藥物泄露會改變藥物代謝動力學(xué)過程和藥效,還可能增大藥物的毒性,因此,泄漏率是評價脂質(zhì)體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[14]。由圖4可知,隨著時間的延長和溫度的升高,2種脂質(zhì)體泄漏率逐漸增大,可能是因為溫度的升高加速脂質(zhì)分子的熱運(yùn)動,造成膜的流動性變大,進(jìn)而使包封于脂質(zhì)體內(nèi)的LI泄漏出來。同時,在相同溫度條件下,HCD-LIFL的泄漏率明顯低于LIFL。37 ℃條件下,6 h時LIFL的藥物泄漏率是HCD-LIFL的1.50倍;12 h后,兩者均達(dá)到平衡,LIFL藥物泄漏率(92%)是HCD-LIFL(58%)的1.59倍。因此將LI用HP-β-CD包合后再制備其脂質(zhì)體能有效抑制脂質(zhì)體藥物的泄漏。

    3 討論

    LI是從傘形科植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根莖中提取的一種有效成分,具有多種藥理作用[15-16],如舒張血管、改善微循環(huán)、抗血小板凝集、活血化瘀、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[17-19]等。臨床用于治療心絞痛以及腦血管疾病等,近年來在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬等方面也逐漸受到關(guān)注。目前常見的制劑有片劑、注射劑[20],但由于口服制劑在體內(nèi)難以吸收,生物利用度低,為達(dá)到治療質(zhì)量濃度需頻繁給藥,易致蓄積LI質(zhì)量濃度超過治療窗甚至中毒,這一問題極大地限制了其開發(fā)應(yīng)用。本課題組前期實驗結(jié)果表明,以丙二醇為柔軟劑制備的FL具有較好的變形性,因而更容易透過黏膜,包封率、穩(wěn)定性和吸收率均較好。但液態(tài)脂質(zhì)體由于不穩(wěn)定易泄露常導(dǎo)致藥效降低,難以達(dá)到治療效果。因此,本實驗將LI包合于HP-β-CD得到HCD-LI,再將HCD-LI包封于FL內(nèi)制得HCD-LIFL,以解決脂質(zhì)體的泄露問題。而HP-β-CD是一種可供注射用的包合物制備材料,常溫下具有良好的水溶性,在體內(nèi)基本不會累積,且包合于其內(nèi)部的藥物在體內(nèi)可迅速釋放,因此,HCD-LIFL是一種安全、穩(wěn)定、有效的新型制劑。

    體外透析實驗結(jié)果表明,HCD-LIFL能明顯減少藥物的泄漏,提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性;而與普通LIFL相比,其包封率明顯提高;脂質(zhì)體粒徑、電位無明顯變化,說明HP-β-CD包合不影響脂質(zhì)體的粒徑及穩(wěn)定性,而且藥物被包埋于HP-β-CD后作為內(nèi)水相制備得到的FL能有效降低水解等作用對藥物的影響,增加制劑的穩(wěn)定性,使其在藥劑學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。

    目前尚未發(fā)現(xiàn)將LI制備成包合物來解決LIFL泄漏的情況。因此,本文通過將LI包載入HP-β-CD中來改變其物理性質(zhì),增加LI分子的體積來減小LI透過磷脂雙分子層的能力,從而延緩脂質(zhì)體內(nèi)水相藥物的泄漏,從根本上提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,解決了液體狀態(tài)下脂質(zhì)體藥物泄漏的問題,為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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