原花青素復(fù)合物的降血脂作用及其含量測定

楊曉君，周 靜，謝 元，買迪娜木·阿布力米提，張玉君，武 運

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

葡萄皮渣作為葡萄酒生產(chǎn)中的主要廢棄物，約占葡萄原料總質(zhì)量的20%～30%，多被企業(yè)丟棄或作為飼料[1-2]，不僅污染環(huán)境，而且浪費資源。近年來，從葡萄加工副產(chǎn)品中提取生物活性物質(zhì)已成為研究熱點[3]。葡萄皮渣中含有豐富的多酚類物質(zhì)，其中以原花青素(OPC)的含量最為豐富[4]，1994年已發(fā)現(xiàn)，OPC可降低血清三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，具有改善動脈粥樣硬化、維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的作用[5]。白藜蘆醇(Res)在釀酒過程中大部分殘留于釀后皮渣中，具有改善代謝紊亂、抗衰老、保護心血管等作用[6-8]。釀后葡萄籽油(GSO)含有豐富的亞油酸和多酚[9-10]，可降低血清LDL-C水平并升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平[11]，具有保護心血管、抗癌、抗氧化等多種生物活性[12-13]，可作為高級優(yōu)質(zhì)食用油，有加工利用的價值。

高脂血癥以血清總膽固醇(TC)、TG和LDL-C水平升高為主要特征，近年來已成為嚴(yán)重威脅我國公民健康的病癥之一，而以具有降血脂效果的天然產(chǎn)物作為膳食干預(yù)改善高脂血癥，可避免因長期服用藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)[14]。OPC、Res和GSO均具有改善血脂水平的作用，但三者的復(fù)配是否具有協(xié)同降血脂作用尚未知。另一方面，OPC作為低聚黃烷化合物具有一定的脂溶性，且Res和OPC均不耐熱與光，二者可在GSO中形成乳狀分散物，有助于二者的保存[15-16]。

析因?qū)嶒炘O(shè)計是一種多因素的交叉分組實驗，可比較各因素、各水平間的差異和各因素間的交互作用，尋找最佳組合[17]。本文設(shè)計2×2×2析因?qū)嶒炋接慜PC、Res和GSO復(fù)合物對于高脂血癥小鼠降血脂效果的交互作用，并采用HPLC法確定復(fù)合物中OPC和Res的準(zhǔn)確劑量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 X-Mark型酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)；高效液相色譜儀(包含DGU-20A HPLC泵、SIL-20A進樣系統(tǒng)，SPD-M20A檢測系統(tǒng)，CTO-20A柱溫箱，日本島津公司)；Kromasil C18色譜柱(北京寶賽希望生物科技有限公司)。

1.2試藥 葡萄皮渣(自制)；原花青素對照品、白藜蘆醇對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)，白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%)，均購自大連美侖生物有限公司；丙硫氧嘧啶(上海藍(lán)季生物有限公司)；正己烷、環(huán)己烷、氯化鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉、乙二胺四乙酸(天津永晟化工有限公司)；膽固醇(成都市科隆化工試劑廠)；丙硫氧嘧啶(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；吐溫-80、丙二醇、硫酸高鐵銨、正丁醇、石油醚，均購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；膽酸鈉(南京奧多福尼生物有限公司)；滅菌全價顆粒飼料，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；TG測試盒、TC測試盒、LDL-C測試盒、HDL-C測試盒，均購自南京建成生物試劑研究所。

2 方法

2.1復(fù)合物的制備

2.1.1OPC的制備 參照文獻[18]方法并加以修飾。稱取釀后葡萄皮渣粉末25 g，加入混合試劑(無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸=95∶5)500 mL，置于圓底燒瓶中，60 ℃水浴回流100 min，重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，即得OPC樣品，4 ℃儲存，備用。

2.1.2GSO的制備 稱取葡萄皮渣粉末20 g，分別加入正己烷和環(huán)己烷21、139 mL，于80 ℃水浴2 h后，減壓濃縮至無溶劑，即得GSO粗油。取GSO粗油，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的復(fù)合鹽(一定比例的氯化鈉、檸檬酸三鈉和乙二胺四乙酸混合制成)進行脫磷，脫磷液以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得GSO樣品，4 ℃儲存，備用。

2.1.3復(fù)合物的配制 精密稱取上述制備的OPC、GSO樣品和Res，置于燒杯中，超聲混勻，即得。

2.2高脂血癥動物實驗

2.2.1高脂乳劑的配制 稱取豬油融化，加入膽固醇和丙硫氧嘧啶攪拌，添加吐溫-80和丙二醇，再緩慢加入膽酸鈉溶液，研磨，加水混勻，即得[18]。

2.2.2分組與造模 選用體質(zhì)量18～22 g的健康雄性KM小鼠(實驗動物許可證號SCXK[新]2016-0001)，適用性喂養(yǎng)1 周后隨機分為對照組、高脂組和8個實驗組，每組12只。對照組灌胃去離子水，高脂組和實驗組每日灌胃高脂乳劑，劑量為0.01 mL·g-1。10 d后，按照給藥劑量分別給予復(fù)合物溶液40 d。小鼠每周稱定1次體質(zhì)量，自由進食進水，末次給藥后禁食不禁水。

2.2.3劑量設(shè)計 按照文獻[19-21]，設(shè)置OPC高、低劑量(200、100 mg·kg-1)，Res高、低劑量(100、50 mg·kg-1)，GSO高、低劑量(30、20 mg·kg-1)。析因?qū)嶒炘O(shè)計及各組給藥劑量見表1和表2。

表1 2×2×2析因?qū)嶒炘O(shè)計

表2 各組給藥劑量

2.2.4血脂指標(biāo)的測定 各組小鼠眼眶采血，分離血清，按照試劑盒說明書分別檢測血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平。

2.3復(fù)合物中OPC和Res的含量測定

2.3.1溶液的配制

2.3.1.1OPC對照品溶液 采用高鐵鹽催化法[22]制備。精密稱取OPC對照品10 mg，加甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的OPC儲備液。精密吸取上述儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定溶至刻度，再分別吸取1 mL，加入0.2 mL硫酸高鐵銨溶液和8.8 mL正丁醇，搖勻，水浴加熱1 h，用正丁醇定容，即得OPC系列對照品溶液。

2.3.1.2Res對照品溶液 精密稱取Res對照品10 mg，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的Res儲備液。精密吸取上述儲備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得Res系列對照品溶液。

2.3.1.3OPC供試品溶液 精密稱取2.1.3項下制備的復(fù)合物溶液2.2 mg，加入石油醚溶解，置于分液漏斗中，用甲醇萃取2次，取下層溶液加入甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，得萃取液。取萃取液，按照2.3.1.1項下方法制備OPC供試品溶液。

2.3.1.4Res供試品溶液 取2.3.1.3項下制備的萃取液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.3.2色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(45∶55)；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；OPC、Res檢測波長分別為550、306 nm。

2.3.3樣品含量計算 復(fù)合物中OPC和Res的含量計算公式為：P=(C×V×N)÷M。

式中，P為OPC或Res含量(mg·g-1)；C為供試品溶液質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；V為體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為復(fù)合物質(zhì)量(mg)。

3 結(jié)果與討論

3.1小鼠體質(zhì)量變化 實驗采用高脂乳劑建立高脂血癥小鼠模型，實驗過程中小鼠未出現(xiàn)明顯不適。小鼠體質(zhì)量變化見表3。由表3可知，經(jīng)40 d高脂乳劑喂養(yǎng)的高脂組小鼠體質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.01)，在給予復(fù)合物喂養(yǎng)后，各組小鼠體質(zhì)量相對高脂組均顯著降低，表明各實驗組均能夠改善小鼠肥胖，其中效果最為顯著的組別為A1B1C1和A2B1C2組。

表3 實驗中各組小鼠體質(zhì)量變化

3.2復(fù)合物對高脂小鼠血脂水平的影響 膽固醇穩(wěn)態(tài)對于維持血脂水平具有重要作用，高膽固醇會增加心血管疾病的風(fēng)險，并與缺鐵性中風(fēng)呈正相關(guān)[23]。各組小鼠血脂檢測結(jié)果見表4。由表4可知，與對照組相比，高脂組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均顯著升高，表明成功建立以高膽固醇為主要特征的小鼠高脂血癥模型。與高脂組相比，各實驗組均能顯著降低TC、TG和LDL-C水平，其中，降TG、TC、LDL-C水平效果最好的分別是A2B1C2、A2B1C1和A2B1C1組。

表4 OPC復(fù)合物對高脂血癥小鼠血脂含量的影響

3.3實驗結(jié)果析因分析

3.3.1OPC、Res和GSO對小鼠TG水平的影響 見表5。由表5可知，OPC、Res和GSO存在交互作用；結(jié)合表4和表5可知，降低TG水平的最佳組合為A2B1C2(P<0.01)。

表5 OPC、Res和GSO對小鼠TG水平的影響

3.3.2OPC、Res和GSO對小鼠TC水平的影響 見表6。由表6可知，Res和GSO的交互作用對于TC影響顯著(P<0.05)，結(jié)合表4和表6可知，對TC作用顯著的最優(yōu)組合為A2B1C1。

表6 OPC、Res和GSO對小鼠TC水平的影響

3.3.3OPC、Res和GSO對小鼠LDL-C水平的影響 見表7。由表7可知，OPC、Res和GSO組合對于LDL-C交互作用明顯(P<0.05)。結(jié)合表4和表7可知，對LDL-C作用顯著的組合為A2B1C1。

表7 OPC、Res和GSO對小鼠LDL-C水平的影響

綜合上述分析，OPC對于高脂血癥小鼠TG、TC和LDL-C水平均存在顯著影響(P<0.01)，Caimari A等[20]研究表明，低劑量的葡萄籽OPC提取物(25 mg·kg-1)喂食高脂飲食倉鼠15 d即可顯著避免脂肪積累，改善血脂水平，表明OPC在復(fù)合物降血脂作用中處于主要地位。而OPC、Res和GSO三者復(fù)配對于小鼠TG和LDL-C水平存在顯著交互作用(P<0.05)，協(xié)同降血脂效果顯著優(yōu)于單一成分。推斷最佳降血脂組合為A2B1C1，即OPC、Res和GSO分別 200、50、20 mg·kg-1。

3.4復(fù)合物中OPC和Res的含量測定 HPLC法測定復(fù)合物中OPC和Res含量，確定復(fù)合物中OPC和Res對小鼠降血脂作用的準(zhǔn)確劑量，為復(fù)合物質(zhì)量的分析檢測提供參考。

3.4.1OPC和Res的HPLC圖 見圖1。

圖1 HPLC圖

3.4.2OPC和Res的含量測定結(jié)果 以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，得OPC和Res的線性方程分別為y1=253.22x1+27 285(r1=0.999 1)，y2=110 792x2-72 966(r2=0.999 8)，線性范圍和檢出限(S/N=3)見表8。按照2.1.3項下方法平行配制3份復(fù)合物溶液，分別測得復(fù)合物中OPC和Res含量分別為26.5%、23.8%，精密度RSD值分別為0.59%、0.29%。按照2.1.3項下方法平行配制6份復(fù)合物溶液，按照50%加樣回收進行HPLC檢測，測得復(fù)合物中OPC和Res的加樣回收率分別為101%、105%，符合理化分析要求。

表8 OPC和Res的含量檢測結(jié)果

OPC的常用檢測方法有香草醛-鹽酸檢測法和高鐵鹽檢測法，本實驗采用高鐵鹽-HPLC檢測法，其特點是對酸度不敏感，影響小、反應(yīng)穩(wěn)定性和重復(fù)性好[24-25]。OPC極易受熱損失，研究表明[26]，60 ℃條件下加熱48 h時OPC含量出現(xiàn)顯著下降；另一方面，在復(fù)合物溶液的配制過程中，GSO可能將OPC提取物和Res包合形成微膠囊，因此，為使測試物最大限度析出，實驗中嚴(yán)格把控加熱溫度和時間，采取先以石油醚擴大復(fù)合物體積，OPC和Res在甲醇中的溶解度大于在石油醚中的溶解度，因此再用甲醇萃取得到OPC和Res，可使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

本文通過2×2×2析因?qū)嶒灒状斡懻揙PC、Res和GSO復(fù)配對于高脂血癥小鼠降血脂效果的交互作用，結(jié)果表明，三者復(fù)配具有協(xié)同降血脂功效，其中影響最大的是OPC提取物的濃度，并確定復(fù)合物中OPC、Res與GSO降血脂的最佳劑量分別為200、50、20 mg·kg-1。進一步采用高鐵鹽-HPLC法測定了復(fù)合物中OPC和Res的含量分別為26.5%、23.8%。本研究將為利用釀后葡萄皮渣開發(fā)高品質(zhì)、高價值的降血脂功能性食品提供參考，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定理論基礎(chǔ)。