超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中15種真菌毒素含量

鄧新煜 張健希 張京華

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同時測定食品中15種真菌毒素的方法。方法：樣品經(jīng)50%乙腈水溶液提取后，MycoSpinTM 400凈化柱凈化，同位素內(nèi)標稀釋后，上機測定。結(jié)果：在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均回收率為68.87%～109.24%，精密度在1.97%～12.88%。15種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關系良好，線性系數(shù)均大于0.995，檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.6～8.0 μg/kg和1.8～24.0 μg/kg。對生產(chǎn)日期為2019—2020年的多種類糧油食品進行15種真菌毒素的檢測工作，結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的陽性檢出率最高。結(jié)論：該方法靈敏度高、結(jié)果準確可靠，適合于食品中多種真菌毒素的同時快速檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;食品;真菌毒素

真菌毒素是食物或飼料中生長的真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物有害。早在11世紀就出現(xiàn)過真菌毒素中毒事件，麥角菌核中的生物堿是造成中毒的主要原因，因此該病被稱為麥角菌病。麥角急性中毒的癥狀是產(chǎn)生幻覺和肌肉痙攣，引起四肢動脈持續(xù)收縮和壞死。食用發(fā)霉的谷物制成的面包會引發(fā)惡心、嘔吐等癥狀。真菌毒素具有高度污染、劇毒、穩(wěn)定的理化性質(zhì)，在食品加工，運輸以及儲存過程中已存在很長時間，很難破壞。其通過受污染的食物以及飼料直接進入人體以及動物體，或通過動物產(chǎn)品間接進入食物鏈，在人類以及動物體內(nèi)長期積累可導致神經(jīng)毒性、致畸性、致腎毒性、致癌性、致突變性以及致細胞毒性。

根據(jù)污染的普遍度及毒性危害嚴重性分析，黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是真菌毒素中具有劇毒且致癌的化學物質(zhì)，也是近5年國家食品安全監(jiān)督抽檢中重點監(jiān)測的檢驗項目。

傳統(tǒng)的霉菌毒素檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）等。這些方法一般只能針對一種或一類結(jié)構(gòu)類似的毒素進行快速篩選、定性或定量檢測[1]。薄層色譜法簡捷、便利，但重現(xiàn)性差、精密度低;酶聯(lián)免疫法特異性強、前處理簡單，但假陽性率高，不能作為確證方法;氣質(zhì)聯(lián)用法需要衍生化前處理、操作費時費力[2]。與其他真菌毒素檢測方法相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，集高效分離和多組分定性與定量檢測于一體，成為近年來霉菌毒素多殘留檢測技術(shù)的主流方向。

本研究利用Mycospin?400前處理技術(shù)加上同位素內(nèi)標技術(shù)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同時測定花生、玉米、大豆油等糧油食品中的15種真菌毒素的分析方法，為痕量多種真菌毒素和代謝物的同時檢測提供了一個方便、快速、高效、低成本、高通量、標準化的環(huán)境友好型檢測技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

美國AB SCIEX 4000Q超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）;Milli-Q超純水儀（德國默克密理博公司）;Pico17微量離心機（美國賽默飛世爾公司）;BP211D分析天平（德國賽多利斯公司）;MM400型混合研磨儀（德國RETSCH GmbH）。

甲醇、乙腈、乙酸、醋酸：色譜純，德國Merck公司;15種真菌毒素：黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、伏馬菌素B1（FB1）、伏馬菌素B2（FB2）、伏馬菌素B3（FB3）、嘔吐毒素（DON）、15-乙?；鶉I吐毒素（15-ACDON）、3-乙?；鶉I吐毒素（3-ACDON）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）。黃曲霉毒素混標包含B1、G1，濃度為2 μg/mL和B2、G2，濃度為0.5 μg/mL;伏馬毒素混標包含伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3，濃度均為50 μg/mL;嘔吐毒素、鐮刀菌烯酮、15-乙?；鶉I吐毒素、3-乙酰基嘔吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A濃度均為10 μg/mL，以及6種同位素內(nèi)標U-[13C34]-伏馬毒素B1（25 μg/mL）、U-[13C34]-伏馬毒素B2、U-[I3C34]-伏馬毒素B3濃度為10 μg/mL、U-[13C15]-嘔吐毒素（25 μg/mL）、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮濃度為25 μg/mL、U-[l3C20]-赭曲霉毒素A濃度為10 μg/mL（奧地利ROMER LABS公司）;MycoSpin?400多功能凈化柱（奧地利ROMER LABS公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別配制正離子標準曲線和負離子標準曲線，75 μL不同濃度混標加上75 μL同位素內(nèi)標混標混合后進樣，正、負離子濃度如表1、表2所示[3]。標準曲線現(xiàn)配現(xiàn)用，如未能及時使用，在-20 ℃冰箱最多保存1周。

1.2.2 樣品前處理

稱取試樣（25±0.1）g至250 mL三角瓶中，加入100 mL50%乙腈水溶液，于搖床上（250 r/mim）振搖90 min，過濾上清液。取10 mL濾液至試管，同時加入500 μL乙酸渦旋振蕩，混勻后從試管中取750 μL樣液加入MycoSpin?400多功能凈化柱中，蓋上蓋子渦旋振蕩1 min，待樣液的顏色變成淺藍色，折斷MycoSpin?400多功能凈化柱下端封口，將柱放于離心管，以10 000 r/min離心30 s。離心后濾液存留于離心管內(nèi)，從離心管中取75 μL樣液分別加入75 μL正離子內(nèi)標或75 μL負離子內(nèi)標，渦旋振蕩20 s，上機進樣[3]。

1.2.3 色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 um，2.1 mm×100 mm;柱溫：40 ℃;流速：0.3 mL/min;進樣量：

5 μL;流動相A為乙腈溶液，B為0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），梯度洗脫條件如表3所示。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）：正離子、負離子分別掃描;離子源溫度：正離子模式600 ℃，負離子模式520 ℃;氣簾氣：20 psi;碰撞氣：中等;電噴霧電壓：正離子模式：5 500 V，負離子模式：4 500 V;Gasl：55 psi，Gas2：50 psi;其他質(zhì)譜條件參見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

本研究采用MycoSpin?400多功能凈化柱，進一步優(yōu)化提取時間和提取溶劑等條件。采用MycoSpin?400凈化柱能滿足對所有真菌毒素回收率均能達到70%～130%。

2.2 流動相的選擇

運用相同的洗脫程序，選擇3種不同的流動相對15種化合物進行分析。結(jié)果顯示流動相A設置：乙腈;流動相B設置：0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），15種真菌毒素均有較好的響應。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本試驗采用對于極性特征化合物具有良好電離作用的ESI電離源，將各真菌毒素的高濃度標準溶液采用單標進樣，根據(jù)已確定的色譜條件，通過比較確定各真菌毒素的離子化模式。在選定的離子化模式基礎上，不斷調(diào)節(jié)毛細管電壓、錐孔電壓、源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔氣流量等質(zhì)譜參數(shù)來進一步提高各母離子的信號水平[4]。在確定各化合物母離子后，通過掃描方式獲得2個以上的子離子，在豐度由大到小且避免產(chǎn)生相互干擾的原則下，每種真菌毒素化合物最終確定了2個監(jiān)測離子對。通過15種真菌毒素的多反應監(jiān)測（Multitude Reaction Mode，MRM）色譜圖，質(zhì)譜條件可以保證質(zhì)譜峰的良好峰型和豐度。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系、檢出限以及定量限

配制標準溶液，將15種真菌毒素混標和正負離子內(nèi)標混合，繪制標準曲線，結(jié)果見表5。由表5可知，15種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)均可得到良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）均能達到0.995以上。真菌毒素的檢出限用3倍信噪比來確定，而定量限則用10倍信噪比來確定，其中，信噪比為S比N的比值。

2.4.2 回收率和精密度

選擇花生、玉米、小米、薏米和花生油等不同基質(zhì)的樣品，檢查15種真菌毒素在低、中和高濃度下的回收率。結(jié)果見表6。在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均回收率為68.87%～109.24%，精密度在1.97%～12.88%。

2.5 食品檢測中的應用

通過文獻搜索和過去3年來自國家市場監(jiān)督管理總局公示的不合格樣品信息，選定生產(chǎn)日期為2019—2020年，標識生產(chǎn)者地址為廣西、上海、浙江、江蘇、遼寧和四川等地的150批次食品樣品，地區(qū)類型包括城市、農(nóng)村地區(qū)、風景名勝旅游區(qū)和校園周邊。采樣環(huán)節(jié)包括常規(guī)采樣、農(nóng)產(chǎn)品采樣和網(wǎng)絡采樣。抽樣地點包括農(nóng)貿(mào)市場、雜貨店、超級市場和網(wǎng)絡購物。樣品種類有花生、玉米、薏米、小米、花生油、大豆油、甜面醬、番茄醬、芝麻醬、醬油。采用建立的UPLC-MS/MS的方法對150份上述類別中的10種食品進行檢測，結(jié)果見表7。

由表7可知，花生油中黃曲霉毒素B1陽性檢出率最高，高達32.00%，薏米的玉米赤霉烯酮陽性檢出率較高，高達31.81%，而玉米的玉米赤霉烯酮陽性率也達到15.00%，這可能是由于鐮刀菌屬的菌株易在薏米和玉米作物中生長繁殖，且常存在多種毒素同時并存的情況，比如部分花生樣品中同時含有黃曲霉毒素B1和伏馬毒素B1，部分花生油同時檢出黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2。

3 結(jié)語

本研究基于MycoSpin?400前處理技術(shù)以及同位素內(nèi)標稀釋技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種糧油食品中15種真菌毒素的檢測方法。1次預處理以及1次進樣即可同時檢測食物中多種真菌毒素。同時，運用定性以及定量離子進行驗證。該方法便捷、快速、低成本、高性能、高標準、環(huán)保、靈敏度高、結(jié)果準確可靠，可同時檢測痕量不同的真菌毒素和代謝產(chǎn)物，適用于食品中多種真菌毒素的同時檢測。

參考文獻

[1]王瑞國，蘇曉鷗，程芳芳，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料原料中26種霉菌毒素[J].分析化學，2015，43（2）：264-270.

[2]馬帥，王蒙，韓平，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在食品真菌毒素檢測中應用的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2016，7（8）：3020-3024.

[3]張大偉，高和楊，周旌，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測飼料原料、飼料成品中18種真菌毒素含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2018，9（22）：5867-5876.

[4]劉家陽，張月輝，賈宏新.凝膠滲透色譜凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測玉米粉中10種真菌毒素[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2016，28（6）：763-768.