羥基紅花黃色素A對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響研究

段成剛,張 偉,王建綱

[太原鋼鐵(集團(tuán))有限公司總醫(yī)院/山西醫(yī)科大學(xué)第六醫(yī)院,山西 太原030001]

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高,目前我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化(ASO)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。ASO主要發(fā)生在大中動(dòng)脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞中,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是發(fā)生ASO的基本病理?xiàng)l件。內(nèi)皮細(xì)胞是附著于血管壁表面的一層單核細(xì)胞,可分隔血液和血管壁,防止內(nèi)皮下膠原暴露,具有分泌多種血管活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)血管緊張性、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管壁炎性反應(yīng)的作用,還能有效抑制血栓形成,保護(hù)血管壁,一旦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,內(nèi)皮下膠原暴露,血管壁舒縮能力下降,就會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生高血壓病、ASO等疾病[2]。人體內(nèi)有多種物質(zhì)可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,如氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)產(chǎn)生的血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、低密度脂蛋白(LDL)及內(nèi)皮細(xì)胞受刺激時(shí)釋放的內(nèi)皮微顆粒等[3]。在病變?cè)缙?血管內(nèi)皮細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)大量的血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1),VCAM-1具有介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附的作用,隨后陸續(xù)出現(xiàn)其他血管黏附分子,共同介導(dǎo)細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附,使得黏附效率顯著升高,并吸引血液循環(huán)中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附于受損的血管內(nèi)皮表面,單核細(xì)胞激活后,可進(jìn)入血管內(nèi)皮下,并吞噬脂質(zhì)形成大量泡沫細(xì)胞,大量泡沫細(xì)胞存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞下會(huì)不斷抬高血管內(nèi)皮細(xì)胞,使血流受阻,介導(dǎo)ASO發(fā)生[4]。紅花具有活血通絡(luò)、化瘀止痛功效。藥理研究表明,羥基紅花黃色素是紅花的主要活性成分,是一種查爾酮葡萄糖苷[5],廣泛用于血液循環(huán)障礙性疾病,如冠心病、腦血管疾病,效果良好。本研究分析羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡大小的清潔級(jí)雄性SD大鼠20只,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(晉)2019-11,體質(zhì)量120～150 g,予清潔級(jí)喂養(yǎng),室溫維持在23℃。

1.2 藥物及試劑 羥基紅花黃色素A(太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒：大鼠可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1,浙江聯(lián)科生物科技有限公司)、大鼠可溶性血管間黏附因子-1(s VCAM-1,博士德生物)、大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1,博士德生物)、兔抗人細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1,美國(guó)Proteintech公司)、鼠抗人β-actin抗體(美國(guó)Abgent公司)、兔抗鼠ICAM-1、VCAM-1抗體(美國(guó)Proteintech公司)、二抗(美國(guó)Sigma公司)。DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡尼康E800(日本)；5471R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超凈工作臺(tái)(中國(guó)超凈工作臺(tái)制造商)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 將20只4周齡大小的清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和HSYA組,每組10只。HSYA組給予靜脈滴注羥基紅花黃色素A 100 mg＋0.9%氯化鈉注射液250 m L,每日1次,14 d為1個(gè)療程。對(duì)照組大鼠靜脈滴注0.9%氯化鈉注射液250 m L,每日1次。兩組大鼠均給藥2周。

2.2 臟器組織分離 ①材料：苯巴比妥鈉、福爾馬林、0.9%氯化鈉注射液、酒精、三通管、50 m L針筒、1 m L針筒、穿刺針、衛(wèi)生紙、棉簽、解剖板、剪刀、鑷子、止血鉗、分針、組織凍存管、肝素等。②步驟：麻醉前1 d對(duì)SD大鼠禁食,次日用2%苯巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射,用量5～10 m L,注射完畢后將SD大鼠禁食放回籠中,待其失去知覺(jué)。將SD大鼠四肢用圖釘固定在解剖板上,進(jìn)行活體取血,取血后將血液置于肝素沖洗過(guò)的管中,室溫放置數(shù)小時(shí)后以3 500 r/min離心10 min。分離上層血清,分裝后放入超低溫冰箱中保存,用于檢測(cè)血清中ICAM-1、VCAM-1、ET-1濃度。隨后解剖大鼠,用鑷子夾起大鼠腹部皮膚,沿腹部中線(xiàn)剪開(kāi),再依次剪開(kāi)皮膚、腹膜,向上達(dá)劍突部位,充分暴露整個(gè)心臟,用穿刺針平行刺入左心房并保持穩(wěn)定,向心房?jī)?nèi)注入足量0.9%氯化鈉注射液以轉(zhuǎn)換全身血液。觀(guān)察肝臟膨脹、發(fā)白情況,隨后取下胸主動(dòng)脈,分離后放入4%多聚甲醛離心管中進(jìn)行組織固定,剩余動(dòng)物軀體放入專(zhuān)用冰箱中待專(zhuān)人處理。

2.3 胸主動(dòng)脈表面ICAM-1、VCAM-1表達(dá)測(cè)定 ①脫蠟復(fù)水：將胸主動(dòng)脈組織切片,在室溫放置60 min后,浸泡于二甲苯中10 min,之后放入另一個(gè)裝有二甲苯的染虹中再放置10 mim,然后將組織切片逐級(jí)放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各浸泡5 min,最后置于純水中解育5 min,再轉(zhuǎn)移入磷酸鹽緩沖液(PBS)中解育5min。②抗原修復(fù)：首先進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理,即滴3%的過(guò)氧化氫于切片上解育5 min,然后用PBS浸泡清洗3次,每次5 min,盡可能去除殘留過(guò)氧化氫。之后將切片浸入0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中,置于微波爐中高溫加熱至沸騰并保持8 min,待緩沖液自然降至室溫,用PBS再洗5 min。③免疫反應(yīng)：用濾紙擦去周?chē)嘤嗟腜BS,并用PBS稀釋的10%正常山羊血清室溫盒封閉0.5 h。第2日,移去一抗,PBS清洗兩遍,每次10 min,滴加二抗工作液,室溫解育0.5 h,移去二抗,PBS清洗兩遍,每次10 min。④化學(xué)染色：去除多余PBS,滴加預(yù)先配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染液,濕盒孵育。在顯微鏡下監(jiān)測(cè)染色程度,染色結(jié)束后,用PBS洗去染液,每次8 min,清洗3次,再用蘇木素復(fù)染5 min,復(fù)染結(jié)束后用水洗去多余染液,以2%鹽酸溶液處理,再次用水清洗。⑤脫水封片：將切片依次浸泡于50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇各5 min,二甲苯透明化處理2次,每次10 min,脫水處理后洗去多余液體,滴1滴中性樹(shù)膠,蓋上蓋玻片,除去氣泡。最后用Image pro-plus軟件分析免疫組化結(jié)果。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及硝酸鹽還原酶反應(yīng) 取大鼠血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

3 研究結(jié)果

3.1 觀(guān)察指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清sICAM-1、s VCAM-1、ET-1濃度,運(yùn)用免疫組化法測(cè)定SD大鼠胸主動(dòng)脈表面ICAM-1、VCAM-1表達(dá)。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果

(1)血清sICAM-1、s VCAM-1及ET-1濃度比較給藥2周后,HSYA組血清sICAM-1、s VCAM-1濃度均低于對(duì)照組(P＜0.05)；兩組大鼠血清ET-1濃度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組SD大鼠可溶性細(xì)胞間黏附分子-1、可溶性血管間黏附分子-1、內(nèi)皮素-1濃度比較(ng/L,±s)

表1 兩組SD大鼠可溶性細(xì)胞間黏附分子-1、可溶性血管間黏附分子-1、內(nèi)皮素-1濃度比較(ng/L,±s)

注：與對(duì)照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) 可溶性細(xì)胞間黏附分子-1可溶性血管間黏附分子-1內(nèi)皮素-1 HSYA組 10 27.1±2.2▲ 79.5±3.2▲ 301.1±1.5對(duì)照組 10 34.3±2.0 103.1±4.2 311.3±4.2

(2)胸主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1表達(dá)比較 對(duì)照組免疫組化結(jié)果可見(jiàn)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面存在大量棕黃色顆粒狀陽(yáng)性染色物質(zhì),且部分區(qū)域棕黃色顆粒狀物質(zhì)融合成片；HSYA組免疫組化結(jié)果顯示黃色顆粒狀陽(yáng)性染色物質(zhì)明顯少于對(duì)照組,見(jiàn)125頁(yè)圖1、2。

圖1 對(duì)照組免疫組化結(jié)果

圖2 HSYA組免疫組化結(jié)果

4 討論

紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花,味辛,藥性溫和,歸于心、肝經(jīng),為血中氣藥,兼具補(bǔ)血與補(bǔ)氣功效。中醫(yī)常用紅花治療女性閉經(jīng)、痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡及瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌仆損傷、瘡瘍腫痛等血液瘀阻性疾病。小劑量紅花可起到祛瘀生血、益氣養(yǎng)血的功效,大劑量使用則有破血祛瘀的作用。藥理研究表明,紅花含有紅花苷、紅花醍苷、紅花素、二氫黃酮類(lèi)化合物、多糖類(lèi)、葡萄糖苷(新紅花苷)、HSYA等[5]。田文靜等[6]研究表明,紅花對(duì)心臟具有正性作用,可提高冠狀動(dòng)脈血容量,臨床以紅花為主治療冠心病,尤其對(duì)輕、中度慢性心絞痛患者有顯著療效。紅花還能長(zhǎng)時(shí)間降低小動(dòng)物血壓,使狗腎血管強(qiáng)烈收縮,腎血流量減少,并使全血初凝及血液復(fù)鈣時(shí)間明顯延長(zhǎng)[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,紅花煎劑可以刺激小鼠、家兔、貓、狗的子宮,使其產(chǎn)生規(guī)律收縮,甚至強(qiáng)烈痙攣[7],因此孕婦不宜使用紅花,對(duì)月經(jīng)過(guò)多、有流血趨向的女性患者也不適用或應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

HSYA是一種查爾酮葡萄糖苷,實(shí)驗(yàn)研究表明,其具有激動(dòng)血管平滑肌β受體、擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量、改善心肌缺血的作用[8]；同時(shí),HSYA能抑制血小板黏附、聚集和釋放,從而抑制血栓形成。內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是ASO的始動(dòng)環(huán)節(jié)[9]。人體中存在多種可能造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的物質(zhì),其中最主要的是氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基,過(guò)量氧自由基儲(chǔ)存在細(xì)胞或組織中可引起細(xì)胞或組織損傷,尤其是內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后,會(huì)喪失分隔血液與血管壁的作用,造成內(nèi)皮下膠原暴露,直接與血液中的各種成分接觸,血液中的血管性血友病因子(vWF)首先與內(nèi)皮細(xì)胞破損處的膠原纖維產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng),介導(dǎo)血小板與膠原纖維結(jié)合,同時(shí)血小板釋放各種黏附因子,進(jìn)一步加速血小板與膠原纖維的結(jié)合,從而形成聚集效應(yīng)。

綜上所述,HSYA可明顯降低雄性SD大鼠血清sICAM-1、s VCAM-1水平,抑制其胸主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1表達(dá)。