Aurora-B誘導(dǎo)著絲粒蛋白U磷酸化促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖的作用研究

段小輝，申瑤，黃靖波，劉亞暉，毛先海

（1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科/肝膽腫瘤研究室，湖南長(zhǎng)沙410005；2.湖南省膽道疾病防治臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410005）

膽管癌的發(fā)病率約占消化系統(tǒng)的3%，是肝膽癌中第二常見(jiàn)的惡性腫瘤[1-2]。目前，手術(shù)切除是膽管癌的主要治療策略[3]。然而，膽管癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，5年生存率不到5%。因此，探索膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為膽管癌的治療提供藥物靶點(diǎn)對(duì)于膽管癌的防治研究有重要的臨床意義。Aurora 激酶是一類(lèi)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由Aurora-A、Aurora-B 和Aurora-C 3 個(gè)亞型組成。Aurora 激酶參與細(xì)胞中心體的成熟和分離、紡錘體的組裝和穩(wěn)定性、染色體濃度和中板聚集等[4-5]。在哺乳動(dòng)物中，Aurora-B 與INCENP、survivin 和borealin 等其他3 種染色體乘客蛋白形成四聚體，在有絲分裂著絲粒和微管的正確定位中起重要作用[6]。大量研究[7-10]表明，Aurora 激酶的突變?cè)黾恿嘶蚪M的不穩(wěn)定性，其過(guò)度表達(dá)和異?；钚钥蓪?dǎo)致紡錘體缺陷和染色體分離異常，導(dǎo)致細(xì)胞的非整倍體，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在過(guò)去的幾十年中，研究表明Aurora-B 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且已經(jīng)成為一個(gè)重要的抗腫瘤靶點(diǎn)。盡管Aurora-B 在膽管癌中的異常表達(dá)已被證實(shí)[11]，但Aurora-B 對(duì)膽管癌的調(diào)控作用至今未見(jiàn)報(bào)道。

著絲粒蛋白U（CENPU）是著絲粒相關(guān)網(wǎng)絡(luò)重要組成部分，研究證實(shí)CENPU 在有絲分裂的染色體分離過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，CENPU 已被鑒定為Aurora-B 誘導(dǎo)的磷酸化作用的底物之一[12]。本課題組在前期膽管癌中篩選出CENPU 的基礎(chǔ)上，通過(guò)臨床病理標(biāo)本檢測(cè)首次發(fā)現(xiàn)CENPU 在膽管癌中表達(dá)水平明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織，采用siRNA 技術(shù)將膽管癌QBC939 細(xì)胞CENPU 敲減，初步結(jié)果顯示膽管癌細(xì)胞增殖受到抑制，提示CENPU 可能為膽管癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因[13]。因此，結(jié)合膽管癌中Aurora-B 異常表達(dá)以及其可誘導(dǎo)CENPU 磷酸化，推測(cè)Aurora-B 可能通過(guò)CENPU 的磷酸化來(lái)調(diào)控膽管癌的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 免疫組化染色

用免疫組化法檢測(cè)Aurora-B 激酶、CENPU 蛋白以及磷酸化CENPU（p-CENPU）蛋白的表達(dá)。收集10 例膽管癌患者的腫瘤組織和配對(duì)的正常癌旁組織，所有參與的膽管癌患者均提供書(shū)面知情同意書(shū)。所有標(biāo)本在65 ℃的烤箱中烘烤30 min，然后將載玻片在二甲苯中脫蠟30 min，并在100% 至75%乙醇中再水合。將玻片樣本架放入含1×乙二胺四乙酸的修復(fù)缸中100 ℃煮沸30 min，室溫冷卻，然后用3%H2O2封閉5 min，再用5%血清封閉15 min。Aurora-B（1∶100，Affinity，Cat#AF5361），CENPU（1∶50，Affinity，Cat#DF2320），p-CENPU（1∶50，Abcam，Cat#ab117078）抗體孵育4 ℃過(guò)夜，然后加入相應(yīng)的二抗染色。玻片在黑暗中用DAB 染色5 min，蘇木精復(fù)染，使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。玻片在顯微鏡下觀察并拍攝圖像。IHC 評(píng)分采用陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分總和。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分分為4 級(jí)：1 級(jí)（1%～24%），2 級(jí)（25%～49%），3 級(jí)（50%～74%），4 級(jí)（75%～100%）。染色強(qiáng)度從0 分（無(wú)信號(hào)色）到3 分（淺黃色、棕色和深棕色）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

膽管癌細(xì)胞系QBC939 細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于ATCC，并培養(yǎng)于含10%FBS（GIBCO，Cat#10091-148）和青霉素鏈霉素（100×）（GIBCO，Cat#15140122）的DMEM（GIBCO，Cat#1868985）培養(yǎng)液中，置于含5%CO2和濕度為70%～80% 的培養(yǎng)箱中（三洋，Cat#MCO-175），培養(yǎng)溫度為37 ℃。培養(yǎng)基每3 天更換1 次。

1.3 慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

Aurora-B 的shRNA 靶序列由上海懿貝瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)，用限制性?xún)?nèi)切酶Age I 和EcoR I（Cat#R3552L 和R3101L，NEB）線(xiàn)性化LV-013 載體，并與設(shè)計(jì)序列連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌受體細(xì)胞中，用PCR 方法篩選陽(yáng)性克隆。用EndoFree midi 質(zhì) 粒 試 劑 盒（Cat #DP118-2，TIANGEN）提取高純度質(zhì)粒。構(gòu)建CENPU 磷酸化位點(diǎn)（蘇氨酸78）失活突變慢病毒載體。將突變和非突變CENPU 克隆到表達(dá)載體LV-013 中（LV-013 載體元件包含：pCDH-CMV-MCS-3FLAG-EF1-copGFP-T2A-Puro），根據(jù)PCR 測(cè)序結(jié)果構(gòu)建重組表達(dá)載體LV-013-CENPU。在6 孔板中培養(yǎng)QBC939 細(xì)胞，直到細(xì)胞融合達(dá)到80%，使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。培養(yǎng)72 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光表達(dá)情況，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光蛋白（GFP）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 qRT-PCR

收集細(xì)胞并以2 000r/min 離心5 min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中添加1 mL TRIzol（Sigma），并根據(jù)TRIzol 的說(shuō)明提取總RNA。將RNA 沉淀溶解在無(wú)RNase 酶的水中，并使用Nanodrop100 分光光度計(jì)（Thermo，America）分析和測(cè)定提取RNA 的濃度和質(zhì)量。根據(jù)hiscript QRT-super-mix（Vazyme）的說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR-Green-mastermixs 試劑盒的要求制備qRT-PCR 反應(yīng)體系，繪制熔融曲線(xiàn)。以GAPDH 為內(nèi)參照，計(jì)算基因表達(dá)量，2-ΔΔCt代表各靶基因的相對(duì)表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，55 ℃解離1 min。Aurora-B 引物的上游序列：5'-TGG CTC GGG AGA AGA AA-3'，下游序列： 5'-CGC AGG ATG TTG GGA TG-3'。

1.5 Western blot

細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，置于4 ℃冰上至細(xì)胞完全溶解。細(xì)胞裂解樣品在12 000r/min 下離心10 min。提取總蛋白加入1×SDS 上樣緩沖液。蛋白質(zhì)（20 μg/lane）經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用封閉液含5%脫脂牛奶的1×TBST 溶液，置于室溫?fù)u床。然后去除液體，添加抗體，包括CENPU（1∶1 000，Affinity，Cat.#DF2320）、p-CENPU（1∶1 000，Abcam，Cat.#ab117078）以及GAPDH（1∶3 000，Bioworld，Cat.#AP0063），在4℃冰箱孵育過(guò)夜。用1×TBST 清洗3 次，用Goat Anti-Rabbit 二抗（1∶3 000，Beyotime，Cat.#A0208）4 ℃孵育4 h。最后洗膜3 次，用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrote 試劑盒顯色，得到蛋白條帶，拍攝照片。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)

CCK8 法檢測(cè)QBC939 細(xì)胞增殖活性。在96 孔板上接種細(xì)胞，每孔2 000 個(gè)，孵育72 h。每孔加入10 μL 1×10 比例Kit-8 溶液，再孵育4 h。在0、6、12、24、48 h 候用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取自至少3 次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。用SPSS 20.0和GraphPad-Prism 軟件7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。t檢驗(yàn)比較差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。。

2 結(jié)果

2.1 Aurora-B和CENPU在膽管癌中的表達(dá)

為了初步探討Aurora-B 和CENPU 在膽管癌中的作用，首先采用免疫組化方法檢測(cè)了它們?cè)谀懝馨┘鞍┡越M織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，Aurora-B 和CENPU 在膽管癌組織中均有表達(dá)，陽(yáng)性率分別為22.61%和12.34%，而在癌旁組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)（圖1）。從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)[14]收集的數(shù)據(jù)也表明了膽管癌中Aurora-B 和CENPU 的上調(diào)（圖2A-B）。此外，相關(guān)性分析顯示，在膽管癌中，Aurora-B 和CENPU 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.7322，P＜0.05）（圖2C）。進(jìn)一步的免疫組化分析表明，與癌旁組織比較，膽管癌腫瘤組織中p-CENPU 表達(dá)上調(diào)，提示Aurora-B 與CENPU 磷酸化之間存在潛在的聯(lián)系。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析A-B：Aurora-B（AURKB）與CENPU在膽管癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織；C：膽管癌組織中CENPU與Aurora-B的表達(dá)呈正相關(guān)Figure 2 TCGA database analysisA-B:Higher expressions of Aurora-B(AURKB)and CENPU in cholangiocarcinoma tissue than normal adjacent tissue;C:A positive correlation between CENPU and Aurora-B expressions in cholangiocarcinoma

2.2 Aurora-B敲減對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖和CENPU磷酸化的影響

為了驗(yàn)證Aurora-B 在膽管癌中的作用及其機(jī)制，采用轉(zhuǎn)染表達(dá)靶向Aurora-B 的shRNA 的慢病毒載體構(gòu)建了Aurora-B 基因敲減的膽管癌QBC939 細(xì)胞模型。首先采用qPCR 評(píng)估了3 個(gè)靶向Aurora-B的shRNA 對(duì)Aurora-B 的敲減效率，其結(jié)果顯示shAurora-B-2 的效果最佳。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)全部采用shAurora-B-2（簡(jiǎn)寫(xiě)為shAurora-B 組）進(jìn)行細(xì)胞構(gòu)建（圖3A）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，敲減Aurora-B 的表達(dá)可明顯抑制QBC939 細(xì)胞的增殖率（圖3B）。 此外，Western blot 的結(jié)果顯示，shAurora-B 組中CENPU 的磷酸化水平明顯低于轉(zhuǎn)染陰性shRNA 序列對(duì)照組（圖3C）。這些結(jié)果證明Aurora-B 不僅對(duì)膽管癌的細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用，同時(shí)這一作用可能與誘導(dǎo)膽管癌中CENPU 的磷酸化有關(guān)。

圖3 QBC939 細(xì)胞Aurora-B 敲減實(shí)驗(yàn)A：qRT-PCR 檢測(cè)3 個(gè)shRNA 的敲除效率；B：CCK8 法檢測(cè)Aurora-B 基因敲減對(duì)QBC939細(xì)胞增殖的影響；C：Western blot法檢測(cè)Aurora-B基因敲減對(duì)QBC939細(xì)胞CENPU和p-CENPU表達(dá)的影響Figure 3 Experiment of Aurora-B knockdown in QBC939 cellsA:The knockdown efficiencies of 3 shRNAs evaluated by qRT-PCR;B:Influence of Aurora-B knockdown on proliferation of QBC939 cells detected by CCK8 assay;C:Influence of Au-rora-B knockdown on expressions of CENPU and p-CENPU of QBC939 cells determined by Western blot analysis

2.3 CENPU 磷酸化位點(diǎn)變異對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖和CENPU磷酸化的影響

為了揭示Aurora-B 誘導(dǎo)的CENPU 磷酸化在膽管癌細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用，進(jìn)一步構(gòu)建了CENPU 磷酸化位點(diǎn)（Thr78）突變體，并用相應(yīng)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染QBC939 細(xì)胞，同時(shí)以CENPU 野生型QBC939 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。通過(guò)觀察慢病毒載體上GFP 綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算并確認(rèn)對(duì)照組（空載慢病毒）、CENPU-WT（野生型）和CENPU-MUT（磷酸化位點(diǎn)突變體）在QBC939 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率（圖4A）。結(jié)果顯示，CENPU 的磷酸化缺陷減弱了Aurora-B 誘導(dǎo)的CENPU 磷酸化，其具有與Aurora-B 抑制劑相似的作用，但Aurora-B 抑制劑能明顯抑制Aurora-B 的表達(dá)，CENPU 磷酸化位點(diǎn)突變對(duì)Aurora-B 的表達(dá)無(wú)影響（圖4B）。CCK8 的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CENPU-WT 的細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的增殖活性，這一作用能夠被CENPU 磷酸化缺陷所抑制（P＜0.05）（圖4C）。以上結(jié)果均表明CENPU 磷酸化在膽管癌增殖中起關(guān)鍵作用。

圖4 QBC939 細(xì)胞CENPU 磷酸化位點(diǎn)突變與Aurora-B 抑制劑作用實(shí)驗(yàn)A：熒光成像技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、CENPU-WT 組和CENPU-MUT 組慢病毒轉(zhuǎn)染效率（×200）；B：DMSO 或Aurora-B 抑制劑處理后，在有或無(wú)CENPU 磷酸化位點(diǎn)突變的QBC939 細(xì)胞中Aurora-B、CENPU 和p-CENPU 的表達(dá)；C：CCK8 檢測(cè)有或無(wú)CENPU 磷酸化位點(diǎn)突變的QBC939 細(xì)胞的增殖Figure 4 Experiments of phosphorylation site mutation of CENPU and Aurora-B inhibitor treatment in QBC939 cells A:Fluorescence imaging assessment of the lentivirus transfection efficiencies in control,CENPU-WT and CENPU-MUT groups(×200); B:The expressions of Aurora-B,CENPU and p-CENPU in QBC939 cells with or without phosphorylation site mutation of CENPU treated with DMSO or Aurora-B inhibitor; C:CCK8 assay for proliferation abilities of QBC939 cells with or without phosphorylation site mutation of CENPU

3 討論

Aurora-B 是Aurora 激酶家族的3 個(gè)成員之一。其位于細(xì)胞核中央，屬于功能性激酶，參與有絲分裂的調(diào)控。近年來(lái)，Aurora 激酶家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。許多研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-B 在多種的人類(lèi)癌癥中都有表達(dá)升高的現(xiàn)象，這顯示出其與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的潛在相關(guān)性。例如，Shen 等[11]研究了有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白（包括Aurora 激酶、survivin 和p53）在膽管癌中的表達(dá)和生物學(xué)功能。他們的研究成果顯示37.8%的肝內(nèi)膽管癌患者的癌細(xì)胞內(nèi)存在著Aurora-B 的過(guò)度表達(dá)，同時(shí)Aurora-B 的表達(dá)與腫瘤分級(jí)之間存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)的關(guān)系。 Al-Khafaji 等[15]認(rèn)為Aurora-B 的活性是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性的一個(gè)重要表征指標(biāo)和調(diào)節(jié)劑。Ding 等的研究[16]揭示了CREPT/RPRD1B 和Aurora-B 之間的相互作用，其結(jié)果說(shuō)明Aurora-B 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的G2/M 周期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。Nie 等[7]還發(fā)現(xiàn)Aurora-B 在胃癌中具有類(lèi)似于癌基因的功能，其能夠通過(guò)激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1 的表達(dá)發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用。另一方面，越來(lái)越多的研究表明，Aurora-B 誘導(dǎo)的磷酸化在人類(lèi)癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。一項(xiàng)最新研究表明，Aurora-B 可以通過(guò)直接誘導(dǎo)MYC 的磷酸化穩(wěn)定其表達(dá)，從而與myc 形成一個(gè)調(diào)節(jié)回路，促進(jìn)T 細(xì)胞白血病的發(fā)生[17]。Xu 等[18]認(rèn)為Aurora-B 誘導(dǎo)的Ser27位點(diǎn)的H1.4 磷酸化在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，而這一功能可被Ras-ERK1/2 信號(hào)通路抑制。盡管已經(jīng)有前期的研究顯示了Aurora-B 在膽管癌中的異常表達(dá)[13,19]，但其在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍不清楚。

2006年，Mellone 等[20-21]首次發(fā)現(xiàn)了CENPU，其又被稱(chēng)為KL1P1、PBIP1 或CENPU/50。其后的研究顯示，CENPU 對(duì)正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是必需的，但在紡錘體損傷恢復(fù)的情況下，對(duì)于黏附和防止姐妹染色單體分離是必需的[22-24]。此外，近年來(lái)研究人員還發(fā)現(xiàn)了CENPU 在多種人類(lèi)癌癥中的重要作用，包括卵巢癌[25]、非小細(xì)胞肺癌[26-27]、膀胱癌[28]、三陰性乳腺癌[29]、肺腺癌[22]和肝細(xì)胞癌[30]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，Aurora-B和CENPU 在膽管癌組織中的表達(dá)水平均有上調(diào)的趨勢(shì)。敲低膽管癌細(xì)胞中Aurora-B 的表達(dá)水平可顯著抑制膽管癌細(xì)胞CENPU 的磷酸化。研究顯示CENPU 與Aurora-B 激酶均可影響著絲粒與微管的連接，其中CENP-U 通過(guò)與Hec1 交互作用調(diào)控染色體著絲粒與微管的連接[12]，而Aurora-B 激酶負(fù)責(zé)修正著絲粒與微管的錯(cuò)誤結(jié)合[31]；CENPU 與Aurora-B 激酶的過(guò)表達(dá)均能使染色體滯后于分裂中期，導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤，引起基因的不穩(wěn)定性以及非整倍體細(xì)胞數(shù)目的增加，直至發(fā)生癌變[32]。最近Hua等[12]通過(guò)體外激酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)CENP-U 上存在有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白Aurora-B 激酶的磷酸化位點(diǎn)Ser349和Ser350。本研究結(jié)果證實(shí)膽管癌細(xì)胞中Aurora-B 激酶可以調(diào)控CENPU 磷酸化，初步的機(jī)制研究表明Aurora-B 對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖水平的調(diào)控作用可能是通過(guò)其對(duì)CENPU 的磷酸化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)CENPU 的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)這一調(diào)控作用也受到了抑制。

綜上所述，本研究證實(shí)了Aurora-B 對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖水平的促進(jìn)作用，并且顯示這一作用可能是通過(guò)對(duì)CENPU 的磷酸化修飾來(lái)進(jìn)行的。因此，本項(xiàng)研究針對(duì)Aurora-B 調(diào)控膽管癌進(jìn)展的作用進(jìn)行了功能層面的驗(yàn)證以及機(jī)制層面的研究，為膽管癌的分子機(jī)制研究以及靶向藥物研究提供了理論依據(jù)以及潛在的分子靶點(diǎn)。