基于血漿循環(huán)游離DNA與甲狀腺結(jié)節(jié)超聲特征構(gòu)建甲狀腺癌診斷模型及其驗證

余幼林，沈雄山，胡超華，余軍林，盧婷，楊峰，張文杰，張小莉，劉漢忠，陶溢潮

（武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院1.甲狀腺乳腺外科2.腫瘤科3.病理科4.超聲科，湖北孝感432000; 5.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州121000）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1-2]。臨床上，甲狀腺超聲檢查聯(lián)合細(xì)針穿刺抽吸活檢（ultrasound-fine needle aspiration biopsy，US-FNAB）被認(rèn)為是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別主要手段[3-5]。但仍然存在自身局限性。甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)在超聲聲象表現(xiàn)上存在交叉、重疊現(xiàn)象，超聲操作者診斷帶有自身主觀性。FNAB 操作有創(chuàng)，并非所有結(jié)節(jié)能實現(xiàn)有效取材，特別是位置特殊，較小結(jié)節(jié)。在獲取組織細(xì)胞診斷仍存在30%不能明確[6]。單一檢測手段其臨床價值有限。因此，探索建立新的無創(chuàng)檢測方法對提高診斷甲狀腺癌準(zhǔn)確率具有重要意義。

外周血循環(huán)游離的DNA（cfDNA）來源于細(xì)胞壞死或凋亡后釋放的DNA 片段或增殖細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）主動分泌DNA 片段。包含了循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）[7-10]。cfDNA 在甲狀腺癌中的研究處于初級階段。有研究[13]顯示：cfDNA 在甲狀腺癌診療中可作為的潛在生物標(biāo)志物[11]。檢測cfDNA 片段的完整性可用于甲狀腺癌的診斷[12]。cfDNA 定量聯(lián)合BRAF V600E 突變檢測可用于甲狀腺癌早期診斷。因此，在本研究通過檢測甲狀腺結(jié)節(jié)患者cfDNA 濃度，聯(lián)合甲狀腺結(jié)節(jié)超聲特征性改變建立評分系統(tǒng)分析在甲狀腺癌診斷中臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月—2020年10月在武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）住院治療240 例甲狀腺結(jié)節(jié)患者為研究對象，按照1∶1 隨機分為建模組120 例，驗證組120 例。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡20～70 歲；⑵有完整甲狀腺+頸部淋巴結(jié)超聲檢查資料；⑶單灶性和多灶性甲狀腺結(jié)節(jié)，無論良惡性結(jié)節(jié)均可；⑷甲狀腺手術(shù)后，明確組織學(xué)病理診斷。切除組織前未行碘131 治療，未經(jīng)任何放化療或者內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴一般臨床數(shù)據(jù)資料不完整；⑵甲狀腺超聲檢查圖像結(jié)果不完整；⑶患有其他腫瘤疾病者；⑷甲狀腺良性結(jié)節(jié)合并惡性結(jié)節(jié)。所有患者均進行手術(shù)明確病理診斷，其中甲狀腺癌132 例，良性甲狀腺結(jié)節(jié)108 例（腺瘤29 例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫囊性變共79 例）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號sw2017002），且研究對象均知情同意簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 超聲檢查術(shù)前所有的患者進行甲狀腺超聲檢查，檢查內(nèi)容：甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)（囊性，非囊性）、縱橫比、包膜完整性、回聲，有無鈣化。超聲檢查設(shè)備采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，機器型號RESONA7，探頭L11-3U。甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)超聲檢查圖像見圖1。

圖1 甲狀腺結(jié)節(jié)超聲圖像A：甲狀腺良性結(jié)節(jié)（箭頭所示）；B-C：甲狀腺惡性性結(jié)節(jié)（箭頭所示）Figure 1 Ultrasound images of the thyroid nodulesA:A benign thyroid nodule(shown by the arrow);B-C:A malignant thyroid nodule(shown by the arrow)

1.2.2 cfDNA 檢測⑴樣本采集：術(shù)前240 例患者抽取靜脈血5 mL 置于EDTA 抗凝管中，在室溫下，3 000r/min，離心15 min，取上清置于凍存管放入-80 ℃?zhèn)溆谩＂蒲獫{DNA 的提取及純化：采用血漿游離DNA 提取試劑盒（天根，DP339）提取血漿游離的DNA 并進行純化，按照試劑盒操作說明進行。⑶血漿DNA 的定量：通過熒光定量PCR 反應(yīng)試劑盒（天根）進行DNA 染色，后進行熒光定量PCR，以基因β-actin 作為參照基因，上游引物5'-TAT CCA GGC TGT GCT ATC CC-3'，下游引物5'-CCA TCT CTT GCT CGA AGT CC-3'。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，隨后，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共設(shè)置40 個循環(huán)，同時設(shè)置實驗組和對照組，每組設(shè)置2 個復(fù)孔，由已知濃度的人HepG2 細(xì)胞提取的DNA 倍比稀釋進行擴增得到Ct（cycle threshold）值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿DNA 的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計量資料的比較采用t檢驗，兩組計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。多因素分析采用Logistic 回歸，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)（β）為0.5513×回歸系數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)對單一指標(biāo)進行評分，構(gòu)建10 分制評分系統(tǒng)，并計算每個人的總得分。cfDNA 及評分的最佳截斷值通過ROC 曲線分析實現(xiàn)。通過Graphpad Prim 進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的血漿cfDNA 的濃度差異

240 例甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)組進行比較，結(jié)果表明，甲狀腺癌組的cfDNA 濃度明顯高于良性結(jié)節(jié)組，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。其中良性結(jié)節(jié)組的cfDNA 濃度的范圍為20.16～78.42 ng/mL，平均（54.35±11.76）ng/mL；甲狀腺癌組的cfDNA濃度的范圍為45.62～84.33 ng/mL，平均（62.16±7.82）ng/mL（圖2）。進一步ROC 曲線分析結(jié)果表明，良惡性結(jié)節(jié)組的cfDNA 濃度的最佳截斷值為56.84 ng/mL（AUC=0.707）（圖3）。

圖2 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的cfDNA濃度比較Figure 2 Comparison of the cfDNA concentrations between patients with benign and malignant thyroid nodules

圖3 cfDNA診斷甲狀腺癌的ROC曲線Figure 3 The ROC curve of cfDNA in diagnosis of thyroid cancer

2.2 基線特征比較

建模組和驗證組患者的基線特征比較結(jié)果顯示，建模組120 例患者中男31 例，女89 例；中位年齡45（28～68）歲。驗證組120例患者中男33例，女87 例；中位年齡46（25～67）歲。cfDNA 濃度及超聲影像（縱橫比，內(nèi)部回聲，包膜，鈣化，囊性病變）在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

表1 建模組和驗證組患者的基線特征比較[n=120，n（%）]Table 1 Comparison of the baseline characteristics between modeling group and validation group[n=120,n(%)]

2.3 建模組中影響甲狀腺癌診斷的單因素分析

建模組中良性和與惡性結(jié)節(jié)兩組比較結(jié)果顯示，兩組間cfDNA 濃度及超聲影像（縱橫比，內(nèi)部回聲，包膜，鈣化，囊性病變）的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）（表2）。

表2 單因素分析建模組中甲狀腺癌診斷的影響因素[n=120，n（%）]Table 2 Univariateanalysisoffactorsforaffectingthediagnosisofthyroidcancerinmodelinggroup[=120,n(%)]

2.4 建模組中影響甲狀腺癌診斷的多因素分析及評分標(biāo)準(zhǔn)

多因素分析結(jié)果表明，cfDNA≥56.84 ng/mL，超聲顯示：縱橫比≥1，不完全包膜，低回聲，鈣化，和非囊性病變是診斷甲狀腺癌的獨立危險因素（均P＜0.05）。根據(jù)Logistic 回歸的標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)（10 分制），cfDNA≥56.84 ng/mL 為1.2 分，超聲指標(biāo)：縱橫比≥1（2.2分），不完全包膜（2.1分），低回聲（1.8 分)，鈣化（1.3 分），非囊性病變（1.5 分）（表3）。

表3 多因素分析建模組中甲狀腺癌診斷的影響因素及評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Multivariate analysis of the factors affecting the diagnosis of thyroid cancer in modeling group and their scoring standards

2.5 單一指標(biāo)及評分系統(tǒng)在甲狀腺癌診斷中的預(yù)測價值

良性甲狀腺結(jié)節(jié)組的綜合評分為3.16±1.77，甲狀腺癌組的綜合評分為7.37±1.52。兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。進一步ROC 曲線分析結(jié)果表明（圖4），該評分系統(tǒng)在建模組中診斷甲狀腺癌的效能較高（AUC=0.958，95%CI=0.926～0.989），高于單一指標(biāo)（縱橫比、內(nèi)部回聲、包膜、囊性病變、鈣化、cfDNA 的AUC 值分別為0.457、0.706、0.752、0.708、0.680、0.715）。評分系統(tǒng)診斷模型最佳截斷值5.5。以最佳截斷值為參考點，其相對應(yīng)的敏感度，特異度，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值分別為85.5%，89.7%，89.8%，85.2%，均高于單一指標(biāo)（表4）。在驗證組中，該模型診斷甲狀腺癌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為83.8%、86.2%、86.7%、83.3%，AUC 為0.902（95%CI=0.848～0.957），高于單一指標(biāo)（縱橫比、內(nèi)部回聲、包膜、囊性病變、鈣化、cfDNA 的AUC 值分別為0.498、0.712、0.731、0.701、0.668、0.709）（表4）。

圖4 評分系統(tǒng)的ROC曲線A：建模組；B：驗證組Figure 4 The ROC curves of scoring systemA:Modeling group;B:Validation group

表4 建模組中單一指標(biāo)及評分系統(tǒng)在甲狀腺癌診斷中的診斷效能（%）Table 4 Predictiveefficacyof singlefactorand the scoresystem fordiagnosis of thyroidcancerinmodelinggroup(%)

3 討論

據(jù)癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：甲狀腺癌目前是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1-2]。臨床上，甲狀腺超聲檢查聯(lián)合US-FNAB 用于甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)鑒別診斷常用的方法。但仍然存在20%～25%細(xì)胞學(xué)診斷不能明確[14]。即使對部分結(jié)節(jié)重復(fù)FNAB，還是有大約9.9%～47.8% 無法診斷或意義不明確[15]。US-FNAB 聯(lián)合分子診斷也是相對較低敏感度（48%～63%）[16-17]和相對較低特異度（48%～53%）[18]。最近研究顯示：US-FNAB 對甲狀腺癌診斷敏感度為57.89%[19]。單獨超聲檢查結(jié)果與病理診斷的符合率在60%和90%之間波動，診斷差異性較大[14]。

在腫瘤患者中，cfDNA 被增殖腫瘤細(xì)胞釋放，通常攜帶有原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶相同生物學(xué)特性的基因組信息。其濃度的改變及其基因特性變化可間接反映腫瘤的生物學(xué)行為[20-23]。亦有研究證實：cfDNA 可用于腫瘤診斷,治療及預(yù)后監(jiān)測[24-25]。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，cfDNA 濃度在治療前后的變化可作為腫瘤負(fù)荷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[26]。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，化療前cfDNA 低水平患者比高水平者具有更長的生存期，治療后cfDNA 水平低于中位數(shù)的患者總體生存有改善，并且治療反應(yīng)良好[27]。在胃癌患者中，血漿cfDNA 含量與腫瘤大小正相關(guān)。cfDNA 基因改變與組織活檢結(jié)果高度一致。cfDNA 還可預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移性胃癌患者中，cfDNA 濃度中位數(shù)比無轉(zhuǎn)移者高約60 倍[28]。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，cfDNA 濃度較高患者的中位無進展生存期（PFS）和總體生存期（OS）時間較短。cfDNA 可以作為NSCLC 患者預(yù)后預(yù)測生物標(biāo)志物[29]。在小細(xì)胞肺癌中，cfDNA 同樣可用于化療療效評估及腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測[30]。乳腺癌患者cfDNA 高水平與患者不良的PFS 和OS 相關(guān)[31]。在本項研究中發(fā)現(xiàn)：甲狀腺惡性結(jié)節(jié)患者cfDNA 濃度高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)者，cfDNA 可作為甲狀腺癌診斷分子標(biāo)志物。

考慮到上述甲狀腺超聲檢查聯(lián)合細(xì)針穿刺抽吸活（US-FNAB）自身特點的局限性。并分析了cfDNA 在腫瘤診療中臨床應(yīng)用價值。本研究基于甲狀腺癌超聲聲學(xué)特征性改變聯(lián)合cfDNA 構(gòu)建的評分系統(tǒng)診斷模型。在本研究中，ROC 曲線結(jié)果表明：當(dāng)cfDNA 濃度≥56.84 ng/mL 對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性具有較好的鑒別價值。甲狀腺癌超聲聲學(xué)表現(xiàn)為縱橫比≥1 低回聲，鈣化，包膜不完整及非囊性病變，與既往的研究相一致[32-34]。值得關(guān)注的是，在本研究中，cfDNA 的濃度聯(lián)合甲狀腺癌5 個超聲聲學(xué)特征構(gòu)建基于評分系統(tǒng)的無創(chuàng)診斷模型用于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別。該模型cfDNA 評分權(quán)值為1.2，均低于另外的超聲學(xué)特征，可能存在的原因：⑴選取樣本量相對較小。⑵選取臨床病例大部分甲狀腺癌腫瘤負(fù)荷較小，釋放到外周血中cfDNA 含量有限。⑶cfDNA 濃度變化與腫瘤臨床分期具有明顯相關(guān)性。通常，腫瘤TNM 分期越晚，cfDNA 水平越高[35]。本研究中選取大部分早期甲狀腺癌臨床病例。ROC 曲線分析結(jié)果提示該評分系統(tǒng)診斷模型具有較高的診斷效能（AUC=0.958，95%CI=0.926～0.989），且模型最佳截斷值為5.5 分。建模組和驗證組結(jié)果均顯示：當(dāng)評分≥5.5 分診斷甲狀腺癌具有良好的敏感度和特異度，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值，高于傳統(tǒng)的單一指標(biāo)檢測的預(yù)測價值。 該模型對比FNAB+BRAF+超聲診斷方法具有無創(chuàng)，可實現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)動態(tài)監(jiān)測。對于存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移，也具有一定預(yù)測價值。BRAF 基因在中國甲狀腺乳頭狀甲狀腺癌中突變率為71.2%[36]。其他病理類型甲狀腺癌伴有BRAF 基因突變相對較低。對于直徑＜1 cm 或位置較深，富血供的甲狀腺結(jié)節(jié)，F(xiàn)NAB 穿刺更易出現(xiàn)取材結(jié)果不滿意[37-38]，導(dǎo)致診斷甲狀腺癌假陰性率較高，該模型可有效彌補上述方法缺陷。同時，本研究也存在一些局限性：⑴本研究總體樣本量較少，需要多中心更大樣本量的檢驗診斷效能；⑵本研究尚未進一步分析該模型在不同臨床分期甲狀腺癌中診斷價值以及在不同甲狀腺癌病理分型中的診斷效能，后續(xù)將開展相關(guān)研究。

總之，本研究基于cfDNA 的濃度和甲狀腺癌超聲特征性聲學(xué)改變建立評分系統(tǒng)診斷模型用于甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)鑒別，為甲狀腺癌的無創(chuàng)診斷提供了新思路。更值得關(guān)注的是這個診斷模型也可用于甲狀腺良性結(jié)節(jié)動態(tài)無創(chuàng)監(jiān)測，在甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷和動態(tài)監(jiān)測中具有重要的臨床價值。