解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有害菌、有益菌抑菌性能的研究初報(bào)

王政露，肖明霞，王乙茹，柳成東，趙 平，錢錦花，楊保和，屈 娥*，程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；3.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653100；4.云南快大多畜牧科技有限公司，云南 玉溪 653100）

2020年7月1日起，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了禁止以促生長為目的的藥物飼料添加劑的使用，因此微生態(tài)制劑等功能性“替抗”飼料添加劑的評(píng)估與應(yīng)用技術(shù)受到畜牧行業(yè)的高度關(guān)注[1-4]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）歸類于芽孢桿菌屬細(xì)菌，由于對(duì)植物病原菌有較好的抑制作用，因此目前在農(nóng)業(yè)種植業(yè)中廣泛應(yīng)用[5-7]。盡管解淀粉芽孢桿菌至今未進(jìn)入我國飼料添加劑品種目錄，但因其具有良好的耐熱性，適合飼料制粒，近年來在畜禽養(yǎng)殖中的飼用價(jià)值評(píng)估逐步增多[8-10]。已有動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌顯著提高了斷奶仔豬、肉雞的生長性能[9-12]；然而也有報(bào)道稱飼用解淀粉芽孢桿菌沒有明顯改善豬雞的生長性能[13-14]。以上飼養(yǎng)試驗(yàn)報(bào)道的矛盾提示：評(píng)估飼用微生態(tài)制劑對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的飼養(yǎng)試驗(yàn)易受試驗(yàn)菌株、試驗(yàn)動(dòng)物、養(yǎng)殖條件、試驗(yàn)設(shè)計(jì)等因素的干擾，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性不穩(wěn)定[15-16]，且動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)的周期較長、費(fèi)用高。因此，建立體外科學(xué)、高效的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估方法與技術(shù)，可能更有助于加快解淀粉芽孢桿菌作為飼用益生菌的潛在價(jià)值評(píng)估。

抑菌性能是飼用微生態(tài)制劑平衡畜禽腸道菌群、促進(jìn)生產(chǎn)性能的重要機(jī)制之一[4]。因此，針對(duì)畜禽腸道主要有害菌及有益菌，采用體外抑菌試驗(yàn)技術(shù)評(píng)估解淀粉芽孢桿菌的抑菌性能，能夠驗(yàn)證飼用解淀粉芽孢桿菌在畜禽體內(nèi)發(fā)揮平衡腸道菌群、促進(jìn)生長的確切效果。體外牛津杯法是微生態(tài)制劑抑菌作用的最常見評(píng)估方法之一[4]，已被用于解淀粉芽孢桿菌抑菌性能的評(píng)估[17-19]。然而，現(xiàn)有的報(bào)道集中在解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有害菌的抑制研究[17-20]，對(duì)腸道有益菌抑制作用的報(bào)道較少[21]，顯然這不利于全面評(píng)估解淀粉芽孢桿菌平衡腸道菌群、改善畜禽生產(chǎn)性能的作用。據(jù)此，本研究較為系統(tǒng)地開展了解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌及有益菌的抑菌作用評(píng)估，以期為解淀粉芽孢桿菌在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 微生物及指示菌

從云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物種植基地分離出一株具有降解化學(xué)農(nóng)藥的解淀粉芽孢桿菌，經(jīng)16S RNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌并命名為YNAU 6172，用于本次抑菌試驗(yàn)評(píng)估。

試驗(yàn)用指示菌包括2 類6 個(gè)：（1）腸道有害菌：大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）；（2）腸道有益菌：羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525）。以上菌株購買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌試驗(yàn)

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌及指示菌的培養(yǎng)

（1）LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL。用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及指示菌大腸桿菌K88和大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌；

（2）MRS培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、蒸餾水1 000 mL。用于培養(yǎng)指示菌羅伊氏乳酸桿菌；

（3）BBL 培養(yǎng)基：酵母膏2.0 g、蛋白胨15.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖20.0 g、番茄粉5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、肝浸粉2.0 g、1 mL 吐溫-80、蒸餾水1 000 mL。用于指示菌嗜熱雙歧桿菌的培養(yǎng)。

1.2.2 指示菌涂布平板制備

（1）指示菌大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌涂布平板采用LB 培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至50 ℃左右倒入培養(yǎng)皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

（2）指示菌羅伊氏乳酸桿菌和嗜熱雙歧桿菌涂布平板采用MRS培養(yǎng)，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至50 ℃左右倒入培養(yǎng)皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀釋、涂布

（1）將培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌K88 和大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的中菌液各吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進(jìn)行梯度稀釋至10-3，涂布。每次操作每個(gè)指示菌涂3個(gè)培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

（2）將培養(yǎng)24 h的羅伊氏乳酸桿菌吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管中，進(jìn)行梯度稀釋至10-3，涂布。每次操作每個(gè)指示菌涂3 個(gè)培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

（3）將培養(yǎng)48 h的嗜熱雙歧桿菌吸取發(fā)酵原液進(jìn)行涂布。每次操作每個(gè)指示菌涂3個(gè)培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

1.2.4 牛津杯抑菌圈直徑測定

為了評(píng)估解淀粉芽孢桿菌對(duì)2 類6 個(gè)指示菌的抑菌效果，每個(gè)指示菌吸取200 μL 涂布一個(gè)培養(yǎng)皿，并在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置1 個(gè)牛津杯，向牛津杯加入100 μL 培養(yǎng)24 h 的解淀粉芽孢桿菌菌液。放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（Diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑數(shù)據(jù)。

1.2.5 抑菌作用的判定方法

關(guān)于解淀粉芽孢桿菌抑菌作用，目前尚無統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究參考李靜舒等[22]報(bào)道的方法，并依據(jù)所用牛津杯的直徑（7.8 mm），將牛津杯外徑約2 倍（16.0 mm）區(qū)分為敏感與高敏感。因此抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16 mm，高敏感。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上抑菌試驗(yàn)重復(fù)操作3次，抑菌圈直徑數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

測定解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制情況，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示解淀粉芽孢桿菌對(duì)指示菌大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的抑制作用均判定為不敏感（DIZ=7.8 mm）。

圖1 解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制作用情況

2.2 解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制作用

測定解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制情況，結(jié)果見圖2。

圖2 解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制情況

解淀粉芽孢桿菌對(duì)羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用為敏感[DIZ=（11.7±0.6）mm]，對(duì)嗜熱雙歧桿菌的抑制作用判定為不敏感。

3 討 論

3.1 解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

畜禽養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖衛(wèi)生環(huán)境的差異，感染不同類型的腸道致病菌易引發(fā)腹瀉等腸道疾病，造成一定的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失。其中，大腸桿菌

K88[23-24]、大腸桿菌K99[23]、豬霍亂沙門氏菌[25]和雞白痢沙門氏菌[26]是豬雞腸道主要的有害致病菌。圖1 顯示，該株解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌等無抑制作用。M.P.Lisboa等[21]最早報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號(hào)LBM5006）對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均無抑制作用。R.Scholz 等[17]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號(hào)FZB42）對(duì)大腸桿菌沒有抑制作用。董靖等[27]研究也顯示，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號(hào)HE）對(duì)大腸桿菌沒有抑制作用。以上3篇報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，張彤等[28]和夏超篤等[19]通過牛津杯抑菌圖片直觀顯示，解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用均為低敏感，這與本試驗(yàn)結(jié)果接近。

然而，付志英等[29]報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號(hào)KHQH-1）對(duì)大腸桿菌的抑制作用達(dá)到高敏感（DIZ=16.0 mm）。T. Ndlovu 等[18]研究顯示，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號(hào)ST34)對(duì)大腸桿菌（DIZ=18.3 mm）和沙門氏菌（DIZ=25.3 mm）的抑制作用均為高敏感。以上報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果之間差異主要原因可能是解淀粉芽孢桿菌菌株不同，這提示飼用解淀粉芽孢桿菌的研發(fā)需進(jìn)一步篩選顯著抑制畜禽腸道有害菌的優(yōu)勢菌株，才有助于推動(dòng)解淀粉芽孢桿菌作為飼用益生菌進(jìn)入我國飼料添加劑品種目錄，為我國畜牧業(yè)替抗提供更多可選擇的產(chǎn)品及技術(shù)方案。

3.2 解淀粉芽孢桿菌對(duì)腸道主要有益菌的抑制作用

乳酸桿菌和雙歧桿菌是畜禽腸道優(yōu)勢主要有益菌，對(duì)維持畜禽腸道菌群平衡、腸道健康和良好生長性能有重要意義[30-31]。羅伊氏乳酸桿菌是畜禽腸道分布最廣泛、比例最高的乳酸桿菌[31]，嗜熱雙歧桿菌是維持畜禽腸道菌群平衡的重要雙歧桿菌之一[30]。目前，有關(guān)解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有益菌的體外抑菌研究極少。唯一的1篇試驗(yàn)報(bào)道[21]顯示，解淀粉芽孢桿菌對(duì)羅伊氏乳酸桿菌有一定的抑制作用（DIZ=9.8 mm），這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。Teng P.Y.等[32]報(bào)道，飼糧添加解淀粉芽孢桿菌組的肉雞盲腸和回腸乳酸桿菌數(shù)量，與基礎(chǔ)飼糧組沒有顯著性差異。Cao G.T. 等[33]和 Hong Y.X.等[10]進(jìn)一步試驗(yàn)表明，與基礎(chǔ)飼糧組比，飼用解淀粉芽孢桿菌組肉雞盲腸乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低。以上體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)檢測腸道菌群的數(shù)據(jù)與本研究及M.P.Lisboa等[21]體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果基本相符。

然而，Lei X. J. 等[12]和楊敏馨[34]在肉雞以及Li X.等[9]在斷奶仔豬中的飼養(yǎng)試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，飼糧添加解淀粉芽孢桿菌能夠顯著提高腸道乳酸桿菌數(shù)量。結(jié)合以上體外抑菌試驗(yàn)以及飼養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)c道菌群報(bào)道的諸多矛盾，進(jìn)一步提示：解淀粉芽孢桿菌菌株的差異可能造成體外及體內(nèi)抑菌性能的不同，從而最終影響解淀粉芽孢桿菌的飼用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究采用體外牛津杯法評(píng)估了一株解淀粉芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌、有益菌的抑制作用。研究顯示，該株解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K88 及K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等主要腸道有害菌均無抑制作用，且對(duì)腸道有益菌羅伊氏乳酸桿菌有一定的抑制作用。以上結(jié)果提示，解淀粉芽孢桿菌作為飼用微生態(tài)制劑在畜禽飼糧中的開發(fā)需進(jìn)一步篩選與謹(jǐn)慎驗(yàn)證飼喂效果。