三十烷醇、石膏和過磷酸鈣對香菇菌絲生長的影響

方志榮，彭書東，王柯穆，姬宏超，張守武，清 源*

（1.西昌學(xué)院攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川西昌 615013；2.成都大學(xué)，四川成都 610106；3.冕寧萬樹食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，四川冕寧 615600）

香菇［Lentimus edodes（Berk）Singer］ 又名香蕈，為擔(dān)子菌門蘑菇綱蘑菇目類臍菇科微香菇屬真菌，是目前國內(nèi)外需要量最大的食用菌之一。其香氣沁脾，味道鮮美，營養(yǎng)十分豐富，含有一般蔬菜所缺乏的維生素D 源（麥角留醇），被人體吸收后經(jīng)陽光照射，能轉(zhuǎn)變成維生素D，可增強(qiáng)人體的抵抗力。香菇中含有30 多種酶，可糾正人體酶缺乏癥[1]。香菇中的有效成分，能增強(qiáng)人體的免疫及抗菌能力，具有抗腫瘤、抗氧化和抗衰老作用，具有明顯的保肝促肝等作用，具有較高的保健價值[2]。截至2018 年末，我國香菇總產(chǎn)量達(dá)到1.043 2×107噸，占全球香菇總產(chǎn)量的95%以上，產(chǎn)值超過1 000 億元，創(chuàng)造相關(guān)就業(yè)崗位上千萬個，香菇產(chǎn)業(yè)對于解決我國的“三農(nóng)問題”發(fā)揮了重要作用[3]。“十四五”時期是我國實現(xiàn)第二個“百年目標(biāo)”的起步期，也是檢驗精準(zhǔn)脫貧、推動鄉(xiāng)村振興、深化供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重要歷史節(jié)點，我國香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨消費需求升級、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級、經(jīng)營體系升級的巨大挑戰(zhàn)，必須提供高質(zhì)量產(chǎn)品、完善高效益產(chǎn)業(yè)體系和高效完備生產(chǎn)經(jīng)營體系[3]。菌絲體是子實體生長的基礎(chǔ)，其生長情況直接影響香菇子實體的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，探索有效促進(jìn)香菇菌絲體生長速率及長出粗壯濃密的菌絲的方法對香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

三十烷醇(Triacontanol)是由30 個碳原子組成的長鏈脂肪醇，化學(xué)名稱為正三十烷醇，簡稱三十醇，英文縮寫為TA，其化學(xué)式為CH3(CH)28CH2OH，是一種天然、無毒、高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物增產(chǎn)、花卉培養(yǎng)、食用菌栽培，并取得了良好的效果[4]。已有的研究表明，三十烷醇能促進(jìn)蛹蟲草[5]、裂褶菌[6]、蜜環(huán)菌[7]等多種菌絲體的生長。姚占芳等研究表明，三十烷醇對香菇菌絲生長、子實體發(fā)育及半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶的活性均有影響，三十烷醇通過提高菌絲生長速率、胞外酶活性，從而使香菇產(chǎn)量增加了21%[8]。劉成榮等研究表明，三十烷醇與多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)共同作用可以促進(jìn)香菇菌絲體的生長和子實體發(fā)生，并提高香菇子實體蛋白質(zhì)和糖類的含量[9]。

石膏和過磷酸鈣是食用菌生產(chǎn)中常用的兩種輔料。石膏又叫硫酸鈣，不僅可以補(bǔ)充培養(yǎng)基（料）中的硫、鈣元素，而且可以加速培養(yǎng)培養(yǎng)料中基質(zhì)分解，促進(jìn)料中可溶性磷、鉀的釋放，供給菌絲吸收利用；硫酸鈣亦可作為緩沖劑，使培養(yǎng)料pH 值不發(fā)生大的變化[10]。過磷酸鈣，不僅可以補(bǔ)充培養(yǎng)（基）料中磷素、鈣元素，而且可以促進(jìn)微生物的分解活動，有利于培養(yǎng)料的發(fā)酵腐熟[10]；過磷酸鈣也可以作為發(fā)酵過程中氨的吸收劑，減少發(fā)酵過程中氨態(tài)氮的損失[11]；磷元素本身又是子實體生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，有促進(jìn)菌絲健壯生長的效果[10，12]。香菇生產(chǎn)配方中，常將石膏和過磷酸鈣作為輔料配合使用[13-15]，但是將三者配合起來使用的研究甚少。本文通過三十烷醇、石膏、過磷酸鈣對香菇菌絲生長影響的研究，優(yōu)化出三者的最佳組合，為香菇原種、栽培種的培育及栽培料的配制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試香菇菌絲

供試香菇菌絲為品種“香菇238”的菌絲，由冕寧萬樹食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.2 不同來源、濃度的三十烷醇的配制與稀釋

粉劑溶液的配制與稀釋：試驗所用三十烷醇粉劑（純度為90%）購于河南神雨生物科技有限公司，其溶液配制參照紀(jì)蘭英[16]的方法：稱取三十烷醇粉劑和平平加各0.5 g 倒入500 mL 的錐形瓶中，再加100 mL 95%乙醇和100 mL純水，搖勻后水浴加熱至溶解。待溶液冷卻后用蒸餾水稀釋至500 mL 即配成濃度為1 000 mg·L-1的母液。取一定量的母液稀釋成濃度為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1三十烷醇粉劑溶液。

微乳劑溶液的稀釋：三十烷醇微乳劑購于四川潤爾科技有限公司，其有效成分總含量為0.1%，即為有效濃度1 000 mg·L-1的母液，本試驗取一定量的母液稀 釋 成 濃 度 為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1三十烷醇微乳劑溶液。

1.3 固體培養(yǎng)基上香菇菌絲體生長的單因素試驗

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基

250 g馬鈴薯（去皮），葡萄糖20 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂40 g，蒸餾水1 000 mL。

2）單因素試驗步驟

基礎(chǔ)培養(yǎng)基+石膏、過磷酸鈣→配成一定含量石膏和過磷酸鈣的培養(yǎng)基→100 mL 的上述培養(yǎng)基中加入10 mL 不同濃度的三十烷醇粉劑（乳劑）溶液→搖勻→培養(yǎng)基高壓滅菌、倒平板→菌餅接種→25 ℃暗培養(yǎng)→觀察菌絲體的形態(tài)、測定菌絲體的生長速率。

3）三十烷醇濃度對香菇菌絲生長的影響

向100 mL含石膏3.0%、過磷酸鈣1.0%的培養(yǎng)基中加入10 mL 濃度為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1三十烷醇粉劑（乳劑）溶液，探討不同濃度的三十烷醇對香菇菌絲生長的影響。

4）石膏含量對香菇菌絲體的影響

向100 mL 含1.0%過磷酸鈣和一定含量石膏的培養(yǎng)基中加入10 mL濃度為1.5 mg·L-1三十烷醇粉劑（乳劑）溶液，探討0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%含量的石膏對香菇菌絲體生長的影響。

5）過磷酸鈣含量對香菇菌絲體的影響

向100 mL 含3.0%石膏和一定含量過磷酸鈣的培養(yǎng)基中加入10 mL濃度為1.5 mg·L-1三十烷醇粉劑（乳劑）溶液，探討0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%含量的過磷酸鈣對菌絲體生長的影響。

6）菌絲體生長速率測定及菌絲形態(tài)的觀察方法

培養(yǎng)7 d后用游標(biāo)卡尺沿4個方向測量菌絲的生長長度[16]。生長速率（mm/d）的計算采用以下公式[17-18]：菌絲生長速率=菌絲生長長度/菌絲生長天數(shù)，式中菌絲生長長度為mm。觀察菌絲的潔白度、濃稠、粗壯情況等。

1.4 袋料香菇菌絲體生長的正交試驗

1）試驗步驟

取30 kg 干木屑、15 kg 麥麩與45 kg 清水混合均勻→按照正交表中的石膏和過磷酸鈣的含量配制500 g的袋料，同時加入50 mL 三十烷醇粉劑（乳劑）溶液→混勻后裝袋（15 cm×30 cm 的聚丙烯袋）→菌餅接種→25 ℃暗培養(yǎng)→菌絲長滿菌袋培養(yǎng)基上表面后，測定菌絲體的生長速率。

2）試驗設(shè)計

在單因素試驗確定石膏、過磷酸鈣含量及三十烷醇粉劑（乳劑）溶液濃度的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的試驗設(shè)計建立正交試驗表，試驗因素及水平設(shè)置見表1，研究不同石膏、過磷酸鈣含量及三十烷醇粉劑（乳劑）溶液濃度組合對袋料香菇菌絲體生長速率的影響。

表1 正交試驗因素水平

3）菌絲體生長速率測定

每天觀察菌袋香菇菌絲生長狀況，待菌絲長滿培養(yǎng)基上表面，沿菌絲生長前沿劃線，作為測定菌絲生長速率的起點，培養(yǎng)5 d 后，再沿菌絲生長前沿劃線，作為測定菌絲生長速率的終點。

4）試驗結(jié)果驗證

根據(jù)上述正交試驗得出的最優(yōu)組合，進(jìn)行結(jié)果驗證。

1.5 數(shù)據(jù)收集和處理

單因素試驗的結(jié)果采用Excel 2016 進(jìn)行分析并作圖。正交試驗的結(jié)果采用SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析和極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)基上香菇菌絲體生長的單因素試驗

2.1.1 三十烷醇濃度對香菇菌絲生長的影響

從圖1 可見，與不加三十烷醇（三十烷醇微乳劑濃度為0 mg·L-1）相比，0.5～2.5 mg·L-1的三十烷醇微乳劑溶液均能明顯地促進(jìn)香菇菌絲體的生長，其促進(jìn)效果隨濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，三十烷醇濃度為1.0 和1.5 mg·L-1時，香菇菌絲體的生長速率最快，二者對香菇菌絲體生長的促進(jìn)效果幾乎一致。與三十烷醇乳劑含量為0 mg·L-1相比，添加1.0 mg·L-1三十烷醇微乳劑溶液后菌絲體的生長速率提高了11.43%。據(jù)觀察，1.0 mg·L-1三十烷醇微乳劑溶液處理的菌絲較其他幾種濃度稠密、菌落整齊、菌絲粗壯。

圖1 不同濃度的三十烷醇粉劑（乳劑）溶液對香菇菌絲體生長的影響

與不加三十烷醇（三十烷醇粉劑濃度為0 mg·L-1）相比，0.5～2.5 mg·L-1的三十烷醇粉劑溶液均能明顯的促進(jìn)香菇菌絲體的生長，其促進(jìn)效果隨濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)乳劑濃度為1.5 mg·L-1時，菌絲生長速率最快。與三十烷醇乳劑含量為0 mg·L-1相比，添加1.5 mg·L-1三十烷醇粉劑溶液后菌絲體的生長速率提高了12.25%。據(jù)觀察，1.5 mg·L-1三十烷醇粉劑溶液處理的菌絲較其他幾種濃度稠密、菌落整齊、菌絲粗壯（見圖2c）。

圖2 不同濃度的三十烷醇粉劑對香菇菌絲體形態(tài)的影響

綜合考慮，選擇0.5、1.0、1.5 mg·L-1作為正交試驗三十烷醇溶液濃度的三水平。

2.1.2 石膏含量對香菇菌絲體的影響

不同石膏含量對香菇菌絲體的影響見圖3。在三十烷醇和過磷酸鈣濃度一定的情況下，石膏含量對香菇菌絲體生長速率的影響均表現(xiàn)為先增加后抑制的情況。當(dāng)石膏含量為3.0%時，菌絲體的生長速率最快，比石膏含量為0.0%時分別提高了11.57%（微乳劑）和11.89%（粉劑）；添加5%的石膏抑制了菌絲體的生長，其生長速率低于石膏含量0.0%的處理。據(jù)此，選擇2%、3%、4%作為正交試驗石膏含量的三水平。

圖3 石膏含量對香菇菌絲生長速率的影響

2.1.3 過磷酸鈣含量對香菇菌絲體的影響

不同過磷酸鈣含量對香菇菌絲體的影響見圖4。當(dāng)培養(yǎng)基中加入三十烷醇微乳劑溶液時，過磷酸鈣對香菇菌絲體生長的促進(jìn)作用先增大，在過磷酸鈣含量為1%時達(dá)到最大，此后這種促進(jìn)作用開始減弱。當(dāng)磷肥含量為1.0%時，菌絲體生長速率比磷肥含量為0%時提高了18.20%。

圖4 過磷酸鈣含量對香菇菌絲生長速率的影響

當(dāng)培養(yǎng)基中加入三十烷醇粉劑溶液時，過磷酸鈣對香菇菌絲體生長的促進(jìn)作用先增大，在過磷酸鈣含量為0.5%時達(dá)到最大，1%的過磷酸鈣含量與0.5%無明顯差異，此后這種促進(jìn)作用開始減弱，過磷酸鈣含量為2.5%，對香菇菌絲體的生長已經(jīng)沒有促進(jìn)作用了。當(dāng)磷肥含量為0.5%時，菌絲體生長速率比磷肥含量為0%時提高了6.76%。

綜合考慮，選擇0.5%、1%、1.5%作為正交試驗過磷酸鈣含量的三水平。

2.2 菌袋香菇菌絲體生長的正交試驗結(jié)果

三十烷醇微乳劑溶液、石膏和過磷酸鈣的正交結(jié)果見表2。各因素對菌絲體生長速率的影響為過磷酸鈣含量＞三十烷醇微乳劑濃度＞石膏含量。菌絲生長速率最快的最優(yōu)組合為A3B3C3，此時菌絲體的生長速率為3.0 mm·d-1。

表2 三十烷醇微乳劑溶液、石膏和過磷酸鈣對香菇菌絲生長影響的正交試驗結(jié)果

三十烷醇粉劑溶液、石膏和過磷酸鈣的正交結(jié)果見表3。各因素對菌絲體生長速率的影響為過磷酸鈣含量＞三十烷醇微乳劑濃度＞石膏含量。菌絲生長速率最快的最優(yōu)組合為A′3B3C1，此組合不在正交表中，因此需要對最優(yōu)組合進(jìn)行驗證試驗。驗證試驗結(jié)果為：A′3B3C1的菌絲生長速率是2.9 mm·d-1，A′3B3C3菌絲生長速率是2.8 mm·d-1，故最佳組合是A′3B3C1。

表3 三十烷醇粉劑溶液、石膏和過磷酸鈣對香菇菌絲生長影響的正交試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

三十烷醇微乳劑溶液、三十烷醇粉劑溶液二者均能促進(jìn)香菇菌絲體的生長，而且其促進(jìn)生長的濃度相近。此外，我們的試驗已證實由于三十烷醇粉劑溶液配制過程中需要加入平平加、酒精等，而且需要水浴溫度下加熱方能促進(jìn)其溶解，配制程序麻煩，因此建議實際食用菌生產(chǎn)中直接采用三十烷醇微乳劑進(jìn)行稀釋，以便提高工作效率。

三十烷醇微乳劑、石膏和過磷酸鈣作為食用菌生產(chǎn)培養(yǎng)基（料）的輔料，具有提高羧甲基纖維素酶等酶活性[8]、補(bǔ)充培養(yǎng)基（料）中營養(yǎng)成分，促進(jìn)營養(yǎng)料中微生物的活性與繁殖[10]等作用。單因素試驗的結(jié)果表明：與三十烷醇微乳劑、石膏和過磷酸鈣的兩兩組合相比，三者的組合更能促進(jìn)香菇菌絲體的生長。正交試驗極差分析的結(jié)果表明：各因素對菌絲體生長速率的影響為過磷酸鈣含量＞三十烷醇微乳劑濃度＞石膏含量。磷元素是食用菌菌絲生長必需的元素，缺磷會導(dǎo)致菌絲體長勢差、生長慢、菌落形狀不甚規(guī)則、菌絲稀疏[12]。500 g 袋料中加入50 mL 1.5 mg·L-1的三十烷醇微乳劑溶液，顯著地促進(jìn)了香菇菌絲體的生長。樊忠良等的研究表明，三十烷醇能抵抗平菇生料栽培中毛霉和綠色木霉的感染[19]。我們的試驗也證實了1.5 mg·L-1的三十烷醇微乳劑能明顯抑制木霉的產(chǎn)生，降低香菇菌袋感染雜菌的風(fēng)險。

本研究通過正交試驗得出三十烷醇微乳劑、石膏和過磷酸鈣的最佳組合為：石膏含量4%、過磷酸鈣含量1.5%的500 g 袋料培養(yǎng)基中，加入50 mL 1.5 mg·L-1三十烷醇微乳劑溶液，在此條件下，菌袋培養(yǎng)基中香菇菌絲體生長速率最快。