41 ℃溫浴對高效價冷凝集素樣本血常規(guī)檢測結(jié)果的影響

解鴻翔，沈 燕，龐珍珍，孫 彬，王珍妮，謝姝惠，周永列

1浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心 檢驗中心，杭州 3100142山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 山東省千佛山醫(yī)院檢驗科，濟南 2500143臺州學院醫(yī)學院檢驗系，浙江臺州 318000

自動化血細胞分析儀的出現(xiàn)提高了全血細胞計數(shù)的檢測通量和準確性。然而，分析前和分析過程中依然有許多因素可能會影響全血細胞計數(shù)結(jié)果的可靠性，冷凝集素(cold agglutinins，CAs)就是嚴重干擾血細胞分析儀檢測結(jié)果的原因之一。CAs是一種紅細胞自身抗體，主要為IgM型，少部分是IgG和IgA[1]。這些抗體在31 ℃以下溫度時易與紅細胞上的I、i或SP1 3種抗原結(jié)合，造成紅細胞凝集，從而干擾紅細胞計數(shù)和紅細胞相關(guān)參數(shù)的分析，如紅細胞壓積(hematocrit，HCT)、平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)和平均血紅蛋白濃度(mean cell hemoglobin concentration，MCHC)。同時，文獻報道白細胞和血小板表面也存在I/i抗原，所以CAs對白細胞和血小板計數(shù)也會造成一定的影響[2- 3]。對于含有CAs的標本，日常工作中通常將其放置于37 ℃水浴一定時間后進行檢測，以消除CAs對血常規(guī)檢驗的干擾。37 ℃水浴法對于CAs效價較低的標本可基本糾正，但對于CAs效價高者往往糾正程度不夠。有研究表明，在39 ℃～41 ℃短時高溫的情況下，血紅蛋白構(gòu)象和紅細胞形態(tài)基本能維持在正常范圍內(nèi)[4- 5]。在實際工作中，筆者遇到2例含有高效價CAs的患者標本，用37 ℃水浴法處理后，紅細胞參數(shù)未得到完全糾正。由于CAs抗體效價及凝集強度隨溫度上升而降低，本研究嘗試41 ℃水浴30 min處理標本并探討其可行性。

資料和方法

病歷資料病例1，患者中年女性，40歲，因“發(fā)現(xiàn)左側(cè)乳腺癌1月余，為行第2次術(shù)前化療”入院。患者1月余前因“自覺左乳腫塊2周”來浙江省人民醫(yī)院行穿刺活檢術(shù)，病理結(jié)果提示浸潤性癌伴導(dǎo)管內(nèi)癌(高核級)?；颊哂枰员砣岜刃?45 mg、環(huán)磷酰胺0.95 g方案化療，化療后患者無明顯不適；現(xiàn)患者為求第2次術(shù)前化療來浙江省人民醫(yī)院就診。查體：左乳外上象限可及2.0 cm大小腫塊，界清，質(zhì)稍硬，活動可。入院后B超提示脂肪肝，血常規(guī)提示冷凝集素存在，其他實驗室檢查：4 ℃時冷凝集素效價>512，Coomb’s試驗陽性(C3d型)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶67 U/L，堿性磷酸酶124 U/L，三酰甘油5.37 mmol/L，非高密度脂蛋白膽固醇4.42 mmol/L，乳酸脫氫酶289 U/L，雌二醇<10 pg/ml。病例2，患者老年女性，74歲，因“卵巢癌復(fù)發(fā)術(shù)后20余天，要求第1次化療”入院?；颊?6年前診斷為卵巢惡性腫瘤(微乳頭性漿液性癌)并行手術(shù)治療。1月余前因“卵巢癌復(fù)發(fā)可能”于浙江省人民醫(yī)院行開腹探查及腫瘤切除治療，術(shù)后病理提示：淋巴結(jié)(45/61)轉(zhuǎn)移性癌(低級別漿液性癌)?，F(xiàn)患者為行第1次化療來浙江省人民醫(yī)院。查體：缺如子宮，空虛附件。入院后PET檢查提示腫瘤多發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血常規(guī)提示冷凝集素存在，其他實驗室檢查：4 ℃時冷凝集素效價>512，CA- 125 1674.0 U/ml，CA- 199 105.1 U/ml，CA72- 4 32.0 U/ml，D-二聚體3960.0 μg/L，大便常規(guī)白細胞鏡檢++/高倍鏡視野。

檢測方法每例患者采集靜脈血4 ml用EDTA-K2抗凝，分為2管。其中一管分別在室溫(25 ℃)及37 ℃溫育不同時間混勻后，以手動進樣方式用Sysmex XN- 9000血液分析儀進行血常規(guī)分析，另一管41 ℃溫育30 min后以同樣方式上機檢測。血細胞分析儀配套稀釋液、溶血劑均為原廠試劑。同時將上述標本分別用預(yù)熱玻片制作外周血涂片進行瑞氏染色，用顯微鏡觀察紅細胞分布情況。

為了評估孵育本身對結(jié)果的影響，收集門診和住院患者的血常規(guī)標本共74例，排除冷凝集素、溶血、黃疸和乳糜血的干擾，所有標本在室溫下檢測完成后，置于41 ℃水浴箱水浴30、60 min后分別再次上機檢測。采用MedCalc軟件進行Passing-Bablok回歸分析對結(jié)果的一致性進行評價。進一步以1/2 美國臨床實驗室改進修正法規(guī)88允許總誤差和中國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS/T406- 2012 臨床血液學檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》為標準判斷偏差是否可接受，各參數(shù)相對偏差可接受的樣本比例應(yīng)≥80%。

結(jié) 果

標本在不同溫度條件下的血常規(guī)檢測結(jié)果患者1標本在室溫條件下進行血細胞分析，結(jié)果顯示血紅蛋白(hemoglobin，HGB)與紅細胞計數(shù)(red blood cell count，RBC)嚴重比例失調(diào)，HCT明顯減低，MCH及MCHC明顯增高(表1)。觀察標本顯示試管壁上懸浮大量微小的顆粒，血涂片顯示大量紅細胞聚集成團，或成緡錢狀排列(圖1A)。隨后改用37 ℃溫育60 min，結(jié)果顯示RBC值得到部分糾正，但HCT、MCH、MCHC仍顯著異常。37 ℃溫育120 min后進行檢查，RBC明顯升高，HCT、MCH、MCHC亦得到明顯改善，但血涂片瑞氏染色鏡檢仍可見少量紅細胞聚集成團(圖1B)。將標本41 ℃水浴30 min 后再進行檢查，顯示紅細胞參數(shù)均得到較好的糾正，RBC計數(shù)、HCT、MCH、MCHC較室溫條件有顯著提升，涂片染色鏡檢紅細胞分布均勻，無聚集現(xiàn)象(圖1C)；同時處理前后白細胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)、HGB和血小板計數(shù)(platelet count，PLT)等無差異。與室溫檢測結(jié)果相比，WBC在37 ℃ 60 min、37 ℃ 120 min、41 ℃ 30 min 溫育后的檢測結(jié)果相對偏差分別為5.7%、8.3%、3.0%，HGB相對偏差分別為1.4%、2.1%、0.7%，PLT相對偏差分別為10.3%、8.9%、10.8%(表1)。

患者2標本在不同溫度條件檢測結(jié)果顯示，與室溫檢測結(jié)果相比，WBC在37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、41 ℃ 30 min溫育后的檢測結(jié)果相對偏差分別為23.7%、21.9%、26.3%，HGB相對偏差分別為2.1%、1.1%、2.1%，PLT相對偏差分別為3.0%、5.9%、2.3%(表1)。

41 ℃溫育對無冷凝集素標本血常規(guī)檢測結(jié)果的影響進一步收集74例不含冷凝集素的血常規(guī)標本進行結(jié)果一致性和可比性驗證，評估41 ℃孵育本身對結(jié)果的影響。74例標本在41 ℃溫育30、60 min后的檢測結(jié)果分別與室溫條件下的檢測結(jié)果進行Passing-Bablok回歸分析。結(jié)果顯示W(wǎng)BC、RBC、HCT、HGB、MCV、MCH和MCHC各參數(shù)回歸方程的截距95%CI均包括0，斜率95%CI均包括1，說明各參數(shù)41 ℃溫育后的檢測結(jié)果和室溫檢測結(jié)果之間無系統(tǒng)差異和比例差異；PLT無系統(tǒng)差異，但有一定的比例差異(表2)。根據(jù)行業(yè)標準進一步進行結(jié)果可比性驗證，結(jié)果顯示與室溫檢測結(jié)果相比，41 ℃溫育30、60 min后的血常規(guī)結(jié)果各項目相對偏差可接受的樣本比例均≥80%，從專業(yè)上考慮41 ℃溫育和室溫檢測結(jié)果之間的相對偏差均在臨床可接受范圍內(nèi)(表3)。

表1 不同溫育條件下全血細胞計數(shù)部分項目的檢測結(jié)果

A.室溫(×40)；B.37 ℃溫育120 min(×40；37 ℃玻片)；C.41 ℃溫育30 min(×40；41 ℃玻片)

表2 74例血常規(guī)標本在41 ℃溫育30、60 min后的檢測結(jié)果分別與室溫檢測結(jié)果的Passing-Bablok回歸分析Table 2 Passing-Bablok regression analysis of the test results of 74 complete blood count specimens incubated at 41 ℃ for 30 minutes or 60 minutes and at the room temperature，respectively

討 論

CAs是常見的影響血常規(guī)檢測結(jié)果準確性的干擾因素之一。Finland等[6]早在1945年就提出了在37 ℃溫育作為一種消除細胞計數(shù)中CAs干擾的方法。雖然已經(jīng)提出了其他方法，如血漿置換、預(yù)稀釋以及標本與試劑雙重溫育等方法，但37 ℃溫育仍是迄今為止應(yīng)用最廣泛的方法之一。然而在實際工作中遇到CAs效價較高的標本時，37 ℃加熱法和預(yù)稀釋法并不能完全消除CAs干擾，且標本稀釋后可導(dǎo)致某些患者(如重度貧血)的RBC、HGB等檢測結(jié)果的準確性下降[7]。標本與試劑雙重溫育法既要溫育試劑，又要排去儀器內(nèi)原有試劑，檢測空白標本，增加檢測成本，可行性較差[7]。血漿置換法雖然能對紅細胞參數(shù)很好地糾正，但會引起白細胞與血小板丟失，且置換次數(shù)越多丟失現(xiàn)象越嚴重。對于含有高效價CAs的血常規(guī)標本，如何獲得更加真實的檢測結(jié)果仍是值得探究的問題。

表3 41 ℃溫育30、60 min與室溫下血常規(guī)檢測結(jié)果的可比性驗證

為較好消除CAs尤其是高效價CAs對血常規(guī)檢驗的干擾，本研究通過對2例CAs效價>512的患者標本進行41 ℃溫育30 min，并與37 ℃溫育法的檢測結(jié)果比較，顯示41 ℃溫育可以得到更真實的檢測結(jié)果。與傳統(tǒng)37 ℃水浴2 h相比，該法周轉(zhuǎn)時間明顯縮短，又可避免血漿置換這一繁瑣而耗時的過程中可能會引入的一些不確定因素。最近有研究提示，對于含有CAs的標本，41 ℃預(yù)熱1 min后利用網(wǎng)織紅細胞通道可以獲得比傳統(tǒng)的37 ℃預(yù)熱2 h更準確的紅細胞參數(shù)，但MCHC除外[8- 9]。本研究結(jié)果進一步支持41 ℃溫育用于快速糾正RBC及其參數(shù)的可行。同時，研究顯示2例冷凝集標本在不同溫度水浴后的WBC、PLT均較室溫直接檢測有一定程度的升高。研究表明CAs除直接對紅細胞有作用外，也可影響中性粒細胞和血小板計數(shù)[2- 3]，這可能是患者標本溫育后WBC和PLT計數(shù)升高的原因。

溫度作為血紅蛋白和紅細胞的一個重要變構(gòu)因子，過高的溫度可引起從血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)、功能以至紅細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的顯著改變[10- 11]。孫秋瑾等[12]報道43 ℃溫育后會造成標本脂蛋白變性，呈現(xiàn)出絮狀沉淀物，對紅細胞多個參數(shù)構(gòu)成干擾。為了進一步探尋41 ℃水浴法本身對血常規(guī)檢測各個參數(shù)的影響，本研究收集74例無冷凝集素干擾的患者標本，分別在41 ℃水浴30、60 min后與室溫檢測結(jié)果進行比對。結(jié)果顯示除PLT外，其余WBC、RBC、HCT、HGB、MCV、MCH和MCHC各參數(shù)的檢測結(jié)果和室溫檢測結(jié)果之間無系統(tǒng)差異和比例差異。雖然PLT統(tǒng)計學上有一定的比例差異，但根據(jù)行業(yè)標準進一步進行結(jié)果可比性驗證顯示，包括PLT在內(nèi)的各參數(shù)其偏移均在臨床可接受范圍內(nèi)。因此，對于37 ℃水浴無法糾正的高效價CAs標本，41 ℃溫育或許是一種較好的獲取真實紅細胞參數(shù)的替代方法。雖然這一方法仍需要在更大范圍的樣本選擇中得到證實，如原始細胞、非典型淋巴細胞或其他異常細胞存在的標本，因為這些細胞固有的脆弱性，它們可能會因加熱而被破壞。另外，在所有方法中都應(yīng)考慮凝集不完全可逆的可能性。目前血細胞分析儀還不能提供可靠的參數(shù)來確認凝集的完全解決，在計數(shù)前利用預(yù)熱玻片進行血涂片鏡檢可有助于發(fā)現(xiàn)殘余凝集，以及排除其他MCHC升高的原因，例如球形紅細胞增多癥。

此外，本研究也提示了實體瘤與冷凝集之間的罕見關(guān)聯(lián)。CAs通常與感染、藥物反應(yīng)、自身免疫性疾病和血液系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)，在實體腫瘤中的報道非常罕見。眾所周知，ABH血型抗原并非紅細胞所特有，在正常上皮細胞中也表達，但在各種癌癥細胞中顯著減少。I抗原是ABH抗原的前體，并在癌細胞中積累，可能是由于轉(zhuǎn)化不完全所致[13]。在癌癥組織中ABH抗原決定簇的缺失和I抗原增加可能是實體瘤患者出現(xiàn)冷凝集素的重要原因[14]。雖然2例患者均有冷凝集素，但患者血清乳酸脫氫酶水平正?；騼H有輕微升高，HGB和膽紅素均在正常范圍，缺乏溶血的實驗室證據(jù)；此外，患者也沒出現(xiàn)遇冷或受涼后手足發(fā)紺或有雷諾氏現(xiàn)象，因此，尚不符合自身免疫性溶血性貧血的診斷標準。研究顯示患者體內(nèi)是否發(fā)生補體介導(dǎo)的溶血與冷凝集素的效價和熱幅均有一定關(guān)系[15]。此外，氣溫和季節(jié)也可能是影響患者發(fā)病的重要因素之一[16]。

綜上，本研究報道了2例實體瘤患者出現(xiàn)的冷凝集現(xiàn)象，并提出了41 ℃溫浴糾正高效價CAs樣本血常規(guī)檢測結(jié)果的可行性。CAs的存在通常是在實驗室日常工作中隨機發(fā)現(xiàn)的，對于紅細胞參數(shù)尤其是MCHC異常升高，或RBC與HGB比例明顯失調(diào)，應(yīng)考慮冷凝集素的影響，并采取恰當?shù)奶幚矸绞将@得更真實的結(jié)果。