益母草堿預(yù)處理對(duì)大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活能力及TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

胡志良，池 豪，丁水印

1)駐馬店市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 河南駐馬店 463000 2)鄭州市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450000

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是最常見的心血管疾病之一，具有較高的死亡率。通過直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療進(jìn)行早期再灌注仍然是MI最有效的治療方法[1]。然而，再灌注缺血心肌可誘發(fā)繼發(fā)性損傷，即心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷,心肌I/R損傷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。心肌I/R損傷的減輕或消除仍然是MI治療的重要研究課題。益母草堿(leonurine)是藥用植物益母草的主要活性成分，具有活血調(diào)經(jīng)、減輕水腫、抗腫瘤等作用[2-3]。近期有研究[4]證實(shí)，益母草堿對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用。益母草堿能夠通過抑制p38MAPK/MEF2信號(hào)通路抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌重構(gòu)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞I/R損傷，探究益母草堿預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響及可能的作用機(jī)制，以期為心肌I/R損傷的防治提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠心肌細(xì)胞H9c2由美國(guó)ATCC提供。益母草堿(純度>97%)由上海思域化工科技有限公司提供。DMEM高糖培養(yǎng)基由美國(guó)Life Technologies公司提供；胰蛋白酶、胎牛血清由美國(guó)Sigma公司提供；青鏈霉素雙抗由美國(guó)Hyclone公司提供； CCK-8試劑盒由南京碧云天生物技術(shù)有限公司提供；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由日本TaKaRa公司提供；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物有限公司提供；Cleaved Caspase-3、Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、抑制蛋白IκBα抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗由美國(guó)Abcam公司提供；SDS-PAGE配制試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.2 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型的制備方法H9c2細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。參考文獻(xiàn)[6]制備缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型。H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)融合至95%后，棄舊培養(yǎng)液，加入預(yù)先經(jīng)37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和95% N2的混合氣體處理的不含血清的DMEM培養(yǎng)液，置于缺氧小室中，通入體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和95% N2的混合氣體5 min除去氧氣，于37 ℃培養(yǎng)箱中缺氧處理3 h。隨后將缺氧培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理2 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組對(duì)數(shù)期H9c2細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、益母草堿組。正常對(duì)照組細(xì)胞用正常培養(yǎng)液在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞按照1.2方法進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理；益母草堿組細(xì)胞先以20 μmol/L的益母草堿預(yù)處理24 h，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，益母草堿處理時(shí)間及濃度參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè)取對(duì)數(shù)期的H9c2細(xì)胞接種到96孔板中，接種密度為1×104個(gè)/孔，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞單層融合時(shí)按照1.3方法分組處理，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照孔不加細(xì)胞。向各孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡的AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)H9c2細(xì)胞分組處理后，收集細(xì)胞，加入適量結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。檢測(cè)管中加入100 μL細(xì)胞懸液，再加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和PI染液，避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的ELISA法檢測(cè)將H9c2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種到96孔板中，分組處理，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，參照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB和IκBα蛋白的Western blot法檢測(cè)分別收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后取30 μg蛋白上樣行SDS-PAGE電泳，蛋白分離后半干法轉(zhuǎn)膜，用100 g/L脫脂奶粉封閉液封阻1.5 h。TBST洗滌3次，加入稀釋過的Cleaved Caspase-3(1∶500)、TLR4(1∶800)、NF-κB(1∶800)和IκBα(1∶800)一抗4 ℃孵育過夜。洗滌后加入1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參。洗滌后ECL顯影，采用GS-800成像系統(tǒng)獲取并用Image J分析圖像。以目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、益母草堿組間細(xì)胞存活率，凋亡率，細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、TLR4、NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組心肌細(xì)胞存活能力和凋亡的比較見圖1、表1。與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，益母草堿組細(xì)胞存活率升高，凋亡率和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平降低(P<0.05)；提示益母草堿能夠改善缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力降低。

1：正常對(duì)照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：益母草堿組

表1 3組心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.2 3組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的比較見表2。與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量增加(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，益母草堿組TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量降低(P<0.05)；表明益母草堿能夠降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子的釋放。

表2 3組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量的比較(n=3) ng/L

2.3 3組心肌細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖2和表4。與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)，IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，益母草堿組細(xì)胞中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，IκBα蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；表明益母草堿能夠有效抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活。

1：正常對(duì)照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：益母草堿組

表4 3組心肌細(xì)胞中TLR4、NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

MI等心血管疾病是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和病死率仍在增加，嚴(yán)重影響著人類的健康和生命。心肌缺血后恢復(fù)血供造成的再灌注損傷是影響缺血性心血管疾病治療效果的重要原因，也是臨床治療中的一大難題。因此探究心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于尋找相關(guān)心血管疾病的有效治療方案具有重要意義。益母草堿學(xué)名為3,5-二甲氧基-4-羥基-苯甲酸(4-胍基-1-丁酯)，提取自唇形科植物細(xì)葉益母草、益母草、艾蒿益母草，具有利水消腫、活血化瘀、抗腫瘤、抗炎等藥理學(xué)功效[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，益母草堿可用于缺血性腦卒中的治療。目前關(guān)于益母草堿在心血管疾病中的應(yīng)用受到越來越多學(xué)者的關(guān)注，但其對(duì)心肌I/R損傷的影響及其作用機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過缺氧/復(fù)氧處理大鼠心肌細(xì)胞模擬體內(nèi)心肌I/R損傷，進(jìn)而探究益母草堿預(yù)處理對(duì)心肌I/R損傷的影響及可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧可降低心肌細(xì)胞存活率，而益母草堿預(yù)處理能夠提高缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的存活率。心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后凋亡率明顯升高，而益母草堿預(yù)處理可減少缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡中扮演重要角色[10]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，益母草堿預(yù)處理能夠減少缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，即抑制了Caspase-3的激活，提示益母草堿可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡。此外，心肌I/R損傷后可誘導(dǎo)大量炎癥因子的釋放，引起的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重心肌損傷，這也是心肌I/R損傷的主要機(jī)制之一[11]。炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等釋放量的高低能夠在一定程度上反映心肌的受損程度，炎癥因子釋放量越大，心肌受損程度越嚴(yán)重[12]。本實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，益母草堿預(yù)處理能夠明顯降低缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，這與以往的研究[13]結(jié)果(益母草堿能夠減少炎癥因子分泌)一致。

為進(jìn)一步探究益母草堿對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活情況。研究[14-15]表明，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路能夠抑制I/R誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕心肌損傷并改善心臟功能,提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路在心肌I/R損傷過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加，IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)；而益母草堿預(yù)處理可下調(diào)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)，上調(diào)IκBα蛋白的表達(dá)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)推測(cè)，益母草堿預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與阻礙TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。