血漿Th1/Th2細胞因子檢測在血流感染診斷中的應(yīng)用價值

任會均，馬小涵，彭若玉，李 藝，明 亮

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；河南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室 鄭州 450052

血流感染是臨床各科常見的一類疾病，多發(fā)生于機體免疫力低下、抗生素濫用、激素等藥物不合理使用等情況下，若病情得不到及時、有效的控制，可進一步發(fā)展為膿血癥甚至休克、死亡，對患者的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[1]。對于此類感染性疾病，及早明確病原體類型并進行病因治療非常重要[2]。目前，血培養(yǎng)是感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其受標(biāo)本質(zhì)量、培養(yǎng)條件等多種因素的影響，存在靈敏度不高、培養(yǎng)周期長、陽性率低等缺點[3]，在感染早期診斷中的應(yīng)用具有一定的局限性。細胞因子是一類具有細胞活性的小分子蛋白(相對分子質(zhì)量小于40 000)，由各種細胞以自分泌或旁分泌等方式產(chǎn)生，發(fā)揮內(nèi)臟活動、免疫調(diào)節(jié)等多種功能[4]。其中，Th1/Th2細胞因子分別介導(dǎo)細胞免疫及體液免疫，作為機體復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)的代表，可從整體上對機體免疫功能進行評估。近年來Th1/Th2細胞因子在自身免疫性及感染性疾病診斷、治療方面的價值逐漸被關(guān)注，如IL-6、IL-10及降鈣素原(PCT)聯(lián)合用于血液腫瘤患兒膿毒性休克的預(yù)測[5]。流式微球分析技術(shù)(cytometric bead array，CBA)是以熒光微球為載體，通過流式細胞儀對樣本中的多個蛋白同時進行定性和定量分析的方法，具有高通量、高靈敏性、高特異性、操作簡便、重復(fù)性好、檢測快速等優(yōu)勢，尤其在細胞因子檢測方面優(yōu)勢顯著[6]。本研究采用流式CBA檢測血流感染患者血漿Th1/Th2細胞因子水平，探討其在不同病原體感染診斷中的應(yīng)用價值，為臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2018年1月至10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科、感染科住院的患者，結(jié)合病史及血培養(yǎng)結(jié)果，確定170例感染患者納入本研究(血培養(yǎng)陽性組)，患者年齡18～80歲，其中男72例，女98例。170例患者中革蘭陽性菌(G+)感染56例，包括金黃色葡萄球菌25例、其他葡萄球菌10例、鏈球菌6例、腸球菌9例、其他G+菌6例；革蘭陰性菌(G-)感染84例，包括大腸埃希菌31例，肺炎克雷伯桿菌23例，銅綠假單胞菌7例，鮑曼不動桿菌5例，腸桿菌屬5例，其他G-菌13例；真菌感染30例。另收集同時期皰疹病毒、EB病毒感染患者35例(病毒組)，選取健康體檢者280例(健康對照組)。各組間性別、年齡等基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(2019-KY-171)。

1.2 血漿Th1/Th2細胞因子檢測利用EDTA抗凝管采集患者靜脈血，室溫3 000×g離心20 min，分離血漿，對Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)進行熒光標(biāo)記，Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒購自杭州賽基生物科技有限公司。采用BD FACS Canto Ⅱ 流式細胞儀對血漿細胞因子含量進行檢測，以上6種細胞因子檢測的上、下限分別為5 000.0、1.0 ng/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。應(yīng)用Shapiro-Wilk方法對計量資料進行正態(tài)性檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(第25，75百分位數(shù)) [M(P25,P75)]表示，應(yīng)用Kruskal-WallisH檢驗比較多組間Th1/Th2細胞因子水平的差異，采用Bonferroni法進行組間兩兩比較。繪制ROC并計算曲線下面積(AUC)，評價各細胞因子的診斷效能，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿中Th1/Th2細胞因子水平比較見表1。3組間IL-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余5種細胞因子組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步分析(表2)顯示，與健康對照組相比，G+組患者血漿中TNF-α、IL-6及IL-10水平升高；G-組IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-10水平升高；真菌組IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10均升高(P<0.05)(表2)。對血培養(yǎng)陽性組內(nèi)進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，G-組TNF-α、IL-6、IL-10的水平高于G+組；真菌組IFN-γ、IL-10的水平高于G+組(P<0.05)；而G-組與真菌組相比僅IFN-γ差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組患者血漿中細胞因子水平的比較 ng/L

表2 血培養(yǎng)陽性組患者與健康對照組血漿中細胞因子水平的比較 ng/L

2.2 Th1/Th2細胞因子對血流感染的診斷價值見圖1和表3。圖1和表3可知，除IL-2以外，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均可用于預(yù)測血流感染)，其中IL-6與IL-10均具有較高的AUC，但兩者之間的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.176，P=0.240)。對IL-6和IL-10進行聯(lián)合分析，其AUC為0.997(95%CI:0.993～1.000，P<0.01)，靈敏度、特異度為0.982、0.996；與IL-6單項診斷相比較，診斷效能與靈敏度稍高。

圖1 各細胞因子預(yù)測血流感染的ROC曲線

2.3 各細胞因子在區(qū)分G+菌/G-菌/真菌感染中的價值

表3 Th1/Th2細胞因子對于血流感染的預(yù)測價值參數(shù)

2.3.1各細胞因子區(qū)分G+菌/G-菌感染的價值 ROC曲線結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6、IL-10對于區(qū)分G-菌和G+菌感染均具有診斷價值(AUC>0.5且P<0.05)，IL-6與IL-10之間的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.258，P=0.796)，IL-10的診斷效能高于TNF-α(Z=2.968，P=0.003)，IL-6的診斷效能高于TNF-α(Z=2.924，P=0.004)。因此，IL-10和IL-6對于區(qū)分G+菌、G-菌感染具有更高的診斷效能，其中，IL-6靈敏度最高，IL-10特異度最高(表4)。

表4 各細胞因子區(qū)分G+菌/G-菌感染的價值參數(shù)

2.3.2各細胞因子區(qū)分G+菌/真菌感染的價值 ROC曲線分析顯示，IFN-γ、IL-6、IL-10對于區(qū)分G+菌和真菌感染均具有診斷價值(AUC>0.5且P<0.05)，IL-6與IL-10之間的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.646，P=0.519)，IFN-γ與IL-6之間的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.324，P=0.186)，IFN-γ的診斷效能高于IL-10(Z=2.625，P=0.009)。因此，IFN-γ對于區(qū)分G+菌、真菌感染具有更高的診斷效能，它的靈敏度最高(表5)。

表5 各細胞因子區(qū)分G+菌/真菌感染的價值參數(shù)

2.3.3各細胞因子區(qū)分G-菌/真菌感染的價值 ROC曲線結(jié)果顯示，IFN-γ的診斷效能高于IL-6(Z=2.257，P=0.024)。因此，IFN-γ對于區(qū)分G-菌、真菌感染具有更高的診斷效能，它的靈敏度最高(表6)。

表6 各細胞因子區(qū)分G-菌/真菌感染的價值參數(shù)

2.4 IL-6與IFN-γ在預(yù)測血流感染中的應(yīng)用價值G-組患者血漿中IL-6的水平與G+組、真菌組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且表達水平為：G-組>真菌組>G+組。將血流感染組分為G-組和非G-組，ROC曲線分析顯示，IL-6的AUC為0.769(95%CI: 0.700～0.838，P<0.05)，靈敏度、特異度分別為0.857、0.570。

真菌組患者血漿中IFN-γ的水平與G+組、G-組差異有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05)，且在真菌組中表達水平最高。將血流感染組分為真菌組和非真菌組，ROC曲線分析顯示，IFN-γ的AUC為0.808(95%CI:0.741～0.874，P<0.01)，靈敏度、特異度分別為0.933、0.664。

2.5 細胞因子在預(yù)測病毒感染中的價值以靈敏度為縱坐標(biāo)，以(1-特異度)為橫坐標(biāo)，對病毒組和健康對照組進行ROC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-2、IL-4無診斷價值(P>0.05)；IFN-γ、IL-6、IL-10的AUC分別為：0.602(95%CI:0.485～0.718，P=0.049)，0.608(95%CI:0.519～0.698，P=0.037)，0.604(95%CI:0.531～0.677，P=0.048)，但它們的診斷效能、靈敏度、特異度均不高。

3 討論

感染是指細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體侵入人體所引起的局部組織和全身性炎癥反應(yīng)。各種病原微生物侵入機體血液循環(huán)，釋放毒素或代謝產(chǎn)物，誘導(dǎo)細胞因子的釋放及炎癥反應(yīng)，患者從而出現(xiàn)不同程度的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、全身感染、中毒、膿毒癥甚至休克，嚴(yán)重影響患者的治療及預(yù)后[7]。對于疑似感染病例，臨床醫(yī)生通常結(jié)合患者體征、實驗室檢查等進行判斷，進而經(jīng)驗性使用廣譜抗生素或者根據(jù)相關(guān)指南進行用藥，但目前臨床上普遍存在抗生素濫用現(xiàn)象，結(jié)果導(dǎo)致了耐藥菌譜的逐年擴大，甚至是超級耐藥菌的出現(xiàn)，這不僅造成醫(yī)療資源的浪費，更增大了感染者治療的難度及死亡風(fēng)險。因此，及時對感染做出明確診斷，合理選取抗生素進行抗感染治療十分重要。

目前，臨床用于輔助診斷感染的實驗室指標(biāo)主要包括血培養(yǎng)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、PCT、白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例及紅細胞沉降率等，但血培養(yǎng)周期長，對于較難生長的病原菌或已經(jīng)經(jīng)過抗生素治療的患者標(biāo)本，敏感性較差；CRP對感染診斷的靈敏度雖較高，但特異度低且存在延遲反應(yīng)；PCT對局部細菌感染的診斷價值不理想等，因此，目前傳統(tǒng)指標(biāo)存在特異性差、早期診斷不靈敏、易受其他因素影響等缺點[8]。

細胞因子是由細胞產(chǎn)生的小分子活性蛋白，通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式參與多種生理和病理過程。Th1/Th2細胞因子的平衡在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，分別介導(dǎo)細胞免疫及體液免疫[9]。在多種病原微生物感染、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中，Th1/Th2細胞因子均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10-11]。當(dāng)病原微生物及其毒素侵入血液循環(huán)，激活宿主的細胞和體液免疫系統(tǒng)，大量的細胞因子釋放，發(fā)揮促炎或抗炎等作用，以期恢復(fù)機體的免疫平衡。本研究以血流感染(G+/G-/真菌)患者為研究對象，以皰疹病毒及EB病毒感染者、健康體檢者為對照組，檢測G+/G-/真菌患者血漿中Th1/Th2細胞因子的水平，比較各組間細胞因子水平的差異并分別進行ROC分析及聯(lián)合分析，評價它們對感染與否及不同病原菌的鑒別診斷價值。

本研究應(yīng)用流式CBA技術(shù)對血漿細胞因子進行檢測。CBA是利用熒光高分子微球為載體，用抗原特異性單抗進行包被，之后與樣本及熒光素標(biāo)記的抗原特異性單抗(檢測抗體)反應(yīng)，然后采用流式細胞儀對樣本血漿中的細胞因子進行定量測定[12]。以往臨床常采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對細胞因子進行檢測，但由于細胞因子表達量在pg級水平，含量極低，不易檢測，故ELISA方法存在敏感度不夠、準(zhǔn)確性差、重復(fù)性不好等不足，而CBA技術(shù)利用熒光微球的“放大”效應(yīng)，使得細胞因子的檢測具有更高的靈敏性、特異性以及可重復(fù)性[13]。

既往研究[14]顯示IFN-γ可誘導(dǎo)T細胞的凋亡，抑制T細胞的分化，從而發(fā)揮抗炎作用，維持機體的免疫平衡。IL-2是促進T細胞增殖的主要細胞因子，同時還可激活NK細胞、細胞毒性T細胞(CTL)、巨噬細胞以及B細胞，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[15]。TNF-α主要由激活的單核巨噬細胞合成分泌，具有較強的促炎作用[16]。IL-4具有抗炎作用，其通過誘導(dǎo)漿細胞分化產(chǎn)生抗體從而參與體液免疫應(yīng)答[17]。IL-6是一種促炎因子，可募集單核細胞，抑制調(diào)節(jié)性T細胞分化和凋亡，在宿主防御病原體和急性應(yīng)激中起著舉足輕重的作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，血流感染患者血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10的水平明顯高于健康對照組，這是由于病原菌侵入血流后，刺激機體T細胞、B細胞、單核巨噬細胞等增殖、活化，大量的細胞因子產(chǎn)生并釋放，導(dǎo)致血漿中細胞因子水平顯著增高。ROC曲線分析顯示，血流感染組IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均可用于預(yù)測血流感染，其中，IL-6、IL-10的AUC顯著高于IFN-γ、TNF-α、IL-4，且具有更高的靈敏度、特異度，提示 IL-6、IL-10對于預(yù)測病原菌血流感染具有更高的應(yīng)用價值，但兩者的診斷效能差異無統(tǒng)計學(xué)意義。將IL-6、IL-10聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，其靈敏度、特異度均略高于IL-6，臨床可采用IL-6、IL-10聯(lián)合方案對血流感染進行預(yù)測。

對不同類型病原菌感染組間的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，G-菌感染組IL-6水平高于非G-感染組，其機制可能是G-菌的胞壁肽和內(nèi)毒素刺激單核巨噬細胞等釋放大量的IL-6，從而導(dǎo)致血漿中IL-6的升高。ROC曲線分析顯示，IL-6在鑒別G-菌感染中具有較高的診斷效能，且靈敏度較高(85.7%)。由于IL-6在G-菌感染后2 h內(nèi)迅速出現(xiàn)，具有反應(yīng)靈敏、半衰期長等特點[19]，故本研究認(rèn)為IL-6可作為G-菌感染的重要診斷指標(biāo)。

對真菌組與細菌(G+菌/G-菌)組進行統(tǒng)計分析顯示，真菌組患者血漿IFN-γ的水平顯著高于細菌組。這與既往研究發(fā)現(xiàn)一致，真菌感染可導(dǎo)致機體血清IFN-γ水平升高，但具體機制尚不明確，推測可能由于真菌感染可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性細胞免疫，特異性CD4+T細胞產(chǎn)生并釋放大量的IFN-γ等細胞因子，從而激活巨噬細胞、NK細胞、CTL，參與真菌的殺滅。進一步ROC曲線分析顯示，IFN-γ對于真菌感染有較好的診斷效能，且靈敏度較高，對真菌感染具有提示作用。

綜上所述，血流感染患者存在Th1/Th2細胞因子表達的失衡，血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10增高，其中IL-6、IL-10用于預(yù)測血流感染具有更高的價值，且IL-6可作為G-菌感染的重要診斷指標(biāo)，另外IFN-γ對于真菌感染具有提示作用。本研究對血流感染患者血漿Th1/Th2細胞因子譜的檢測，對于血流感染及病原菌類型的預(yù)測具有提示作用，有利于臨床進行感染的早期診斷和合理用藥。