急性胰腺炎患者外周血miRNA?16和miRNA?192表達(dá)及其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

劉興濤 王天舒 覃海森 曹舉潮 黃帥

急性胰腺炎（AP）是急診科常見嚴(yán)重急腹癥之一，其患病率呈不斷上升趨勢［1］。AP 臨床表現(xiàn)不一、病情程度不同、預(yù)后差異較大，尤其重癥AP（SAP）病死率高，嚴(yán)重威脅患者生命安全和生存質(zhì)量［2，3］。因此，對AP 采取及時(shí)有效的預(yù)判和診治極為重要。miRNA是具有功能性、內(nèi)源性的一種非編碼RNA，廣泛參與炎性反應(yīng)、腫瘤形成、代謝及發(fā)育等多種病理生理過程［4］。隨著研究深入，miRNA與AP 關(guān)系越來越受到關(guān)注［5］。本研究探討AP 患者外周血miRNA?16和miRNA?192表達(dá)及與病情嚴(yán)重度的相關(guān)性，以期為診斷和治療AP 提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合AP 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②發(fā)病24 h 內(nèi)入院者；③臨床資料完整；④簽訂知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性炎癥性疾病，惡性腫瘤者；②心肝腎功能嚴(yán)重異常者；③精神疾病者。選取2019 年1 月至2021 年1 月在廣東省第二人民醫(yī)院診治且符合研究要求的91 例AP 患者為研究對象，其中男52 例，女39 例；年齡25-72 歲，平均（58.3±7.9）歲；體質(zhì)指數(shù)18-27 kg∕m2，平均（22.3±1.9）kg∕m2；按照Balthazar CT嚴(yán)重指數(shù)（CTSI）評估患者病情嚴(yán)重程度，6 分以下為輕中度組（n=57），7-10 分為重度組（n=34）。另選擇同期健康體檢者50 例為對照組，男26 例，女24 例；年齡24-75 歲，平均（59.4±6.5）歲；體質(zhì)指數(shù)18-26 kg∕m2，平均（22.5±1.9）kg∕m2。三組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），資料具有可比性。

1.2 外周血miRNA?16 和miRNA?192 檢測 （1）miRNA 提取、純化和定量分析：采集受試者外周靜脈血5 ml，轉(zhuǎn)速15 000 r∕min，離心10 min，收集血清樣本，置于-70℃冰箱保存待測。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（qRT?PCR）測定血清miRNA?16 和miRNA?192 表達(dá)：取上述采集血清，血清總RNA采用TRIzol 試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）提取，取5 μl 總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并檢測其純度和完整度。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Biomiga 公司）說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測血清miRNA?16 和miRNA?192表達(dá)。取cDNA 進(jìn)行qRT?PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s、60℃1 min，共完成40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。采用2?△△Ct法計(jì)算血清miRNA?16 和miRNA?192 相對表達(dá)量。引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成引物。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，例數(shù)∕率表示；計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，（）表示。采用ROC 曲線分析miRNA?16、miRNA?192 對AP 診斷價(jià)值；采用 Pearson 分 析 miRNA ? 16、miRNA ? 192 與APACHEⅡ評分相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組一般資料比較 見表2。

2.2 三組APACHEⅡ評分、血清miRNA?16 和miRNA?192 相對表達(dá)量比較 見表3。

表3 三組APACHEⅡ評分、血清miRNA?16 和miRNA?192 相對表達(dá)量比較（±s）

表3 三組APACHEⅡ評分、血清miRNA?16 和miRNA?192 相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕中度組比較，#P<0.05。

組別輕中度組重度組對照組例數(shù)（例）57 34 50 APACHE Ⅱ評分（分）12.98±2.53*21.24±3.56*#3.42±0.67 miRNA?16 1.21±0.27*1.95±0.23*#0.54±0.13 miRNA?192 1.86±0.38*2.93±0.56*#0.87±0.25

2.3 ROC 曲線分析miRNA?16 和miRNA?192 診斷AP 價(jià)值 見圖1，表4。

圖1 ROC 曲線分析miRNA?16 和miRNA?192 診斷AP 價(jià)值

表4 ROC 曲線分析miRNA?16 和miRNA?192 診斷價(jià)值

AUC 是ROC 曲線下面積，截?cái)嘀到?jīng)ROC 曲線法確定。

2.4 miRNA?16、miRNA?192 與APACHEⅡ評分相關(guān)性miRNA?16 與APACHEⅡ評分呈線性正相關(guān)（r=0.728，P=0.012）；miRNA?192 與APACHEⅡ評分也呈線性正相關(guān)（r=0.795，P<0.05）。

3 討 論

AP 特征主要為局部炎癥反應(yīng)，具有起病急、進(jìn)展快，臨床表現(xiàn)多樣，病情復(fù)雜等特點(diǎn)，死亡率較高［7］。目前臨床AP 診治雖取得較大進(jìn)展，但其病死率仍高達(dá)10%-40%，尤其是重癥患者，在發(fā)病早期若因診斷不明而貽誤最佳治療時(shí)機(jī)，則會(huì)使病死率增加20%-50%。因此，早期預(yù)測病情嚴(yán)重程度關(guān)系到AP 的治療方法和預(yù)后［8］。目前監(jiān)測AP 病情的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要包括C 反應(yīng)蛋白、血沉、降鈣素原等，但它們在反映病情上具有一定程度的滯后，且特異度和敏感度欠佳［9］。

miRNA 一般指由長度22 個(gè)核苷酸左右的、內(nèi)源基因編碼的一種非編碼單鏈RNA 分子，作為診斷和預(yù)測藥物反應(yīng)及生物標(biāo)志物的預(yù)測因子［10］，其具有高度保守性和同源性，且表現(xiàn)出組織的特異性表達(dá)。既往研究表明，miRNA 在AP的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有重要作用，包括參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)、腺泡細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)及維持腺泡細(xì)胞凋亡和壞死的平衡，miRNA 表達(dá)異?？梢宰鳛锳P 評估和診斷預(yù)后的工具［9，11］。目前，AP 仍缺乏特異性的治療方式。隨著生物技術(shù)和測序的不斷進(jìn)步，通過干預(yù)和調(diào)控miR?NA 在機(jī)體內(nèi)的功能或可成為AP 治療的新契機(jī)。但目前對miRNA 應(yīng)用尚處于研究階段，許多miRNA 的潛在作用還沒有被證實(shí)和發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，輕中度組和重度組血清miRNA?16和miRNA?192 相對表達(dá)量明顯高于對照組，重度組明顯高于輕中度組，顯示AP 患者血清miRNA?16和miRNA?192 存在高表達(dá)。另外，從ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，miRNA?16 和miRNA?192 診斷AP 的靈敏度分別為67.27%和72.22%，而特異度分別為63.89%和72.97%，提示其在診斷AP 中具有良好靈敏度和特異度；且miRNA?16 和miRNA?192 與APACHEⅡ評分均呈明顯線性正相關(guān)，且隨著病情加重而增高。因此，我們推測其與AP 程度呈明顯正相關(guān)，在將來可能作為評估AP 嚴(yán)重程度和治療有效性的潛在生物指標(biāo)。

綜 上 所 述，AP 患 者 外 周 血miRNA?16 和miRNA?192 呈高表達(dá)，且與病情程度呈明顯線性正相關(guān)，有望成為研判急性胰腺炎的重要診斷和預(yù)后指標(biāo)。