呼吸道病原核酸檢測法在小兒肺炎鏈球菌感染中的臨床應(yīng)用

賈曉蕓 陳宏君 吳林媛

肺炎鏈球菌（SP）為常見病原菌，全世界每年由于肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)約為120 萬［1］。鏈球菌屬于苛養(yǎng)型細(xì)菌，對培養(yǎng)的條件要求較苛刻，且傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的時間較長，不能幫助臨床醫(yī)師及早識別致病原，易延誤患兒的病情［2］。因此，臨床上需要能高效、快速、精準(zhǔn)檢測呼吸道病原菌的方法，為臨床醫(yī)生提供更好的早期診斷依據(jù)。本文探討呼吸道病原菌核酸檢測在小兒SP 感染中的臨床效果，現(xiàn)報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2013 年兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南［3］；②年齡在1 月至1 歲；③加入本研究前未接受抗生素治療；④家屬知情并簽署知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)病變；②加入本研究前已使用抗生素治療。從2019 年12 月-2020 年12 月廣東省珠海市婦幼保健院兒呼吸科收治的符合研究要求的下呼吸道感染患兒中隨機(jī)抽取350 例，同時采集痰標(biāo)本行痰培養(yǎng)（A 組）和采集咽拭子行呼吸道病原學(xué)核酸檢測（B 組）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法 （1）A 組：在患兒使用抗生素前經(jīng)鼻導(dǎo)管吸痰采集痰液，留取痰標(biāo)本時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，采集標(biāo)本量1 ml 以上，使用專用的痰培養(yǎng)杯，在半小時內(nèi)送檢。檢驗(yàn)科微生物室按常規(guī)操作接種在培養(yǎng)平板內(nèi)，對其進(jìn)行后續(xù)處理。（2）B 組：采集咽拭子前半小時禁止喝水，采樣者用壓舌板固定舌頭，用棉拭子越過舌根到咽后壁、扁桃體隱窩及側(cè)壁，擦拭3 次，把拭子插回采樣裝置中。標(biāo)本送廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心，采用KingFisher 全自動核酸提取儀和廣州美基生物科技有限公司的病毒總核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書和儀器操作手冊，提取標(biāo)本中病毒總核酸。利用多重PCR 和Luminex 懸浮態(tài)芯片技術(shù)進(jìn)行呼吸道病原體核酸檢測，可同時檢測甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒（PIV）、鼻病毒（HRV）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（hMPV）、博卡病毒（BoV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、流感嗜血桿菌（HI）、肺炎鏈球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）、肺炎支原體（MP）和百日咳桿菌（BP）等14 種呼吸道主要病原體。檢測儀器為Luminex MAGPIX 相懸浮芯片系統(tǒng)，按檢測試劑參數(shù)根據(jù)cutoff 值進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3 觀察指標(biāo) 兩組檢查方法中SP 的陽性檢出率、檢測時間及費(fèi)用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，率的比較使用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組檢出病原體比較 A 組SP 陽性28 例，陽性率

8.0%，B 組SP 陽性55 例，陽性率15.7%，B 組SP 陽性率明顯高于A組，P<0.05。此外，B組還檢測出其他病原體，其中病毒158 例（巨細(xì)胞病毒52 例、呼吸道合胞病毒32 例、鼻病毒22 例、副流感病毒22 例、甲型流感病毒10 例、乙型流感病毒8 例、博卡病毒6 例、腺病毒3 例、人偏肺病毒3 例），肺炎支原體32 例，其他細(xì)菌30 例（流感嗜血桿菌14 例、卡他莫拉菌14 例、百日咳桿菌2 例），其中混合感染69 例。

2.2 兩組檢測時間及費(fèi)用比較 A 組痰培養(yǎng)的檢測結(jié)果時間為（76.8±48.2）h，B 組核酸檢測結(jié)果時間（5.6±2.5）h，A 組病原體檢測時間明顯長于B 組，P<0.05。但B 組檢測費(fèi)用456 元∕次明顯高于A 組的69 元∕次，P<0.05。

3 討 論

3.1 小兒SP 肺炎特點(diǎn) 小兒SP 肺炎是由SP 感染引起的急性肺部炎癥，常引起大葉性或節(jié)段性肺部炎癥，其中原發(fā)性SP肺炎多見于3歲以上小兒，因該年齡組機(jī)體防御能力逐漸成熟［4］。繼發(fā)性SP肺炎多見于嬰幼兒，常繼發(fā)于病毒性肺炎［5］。因?yàn)閶胗變簳r期的免疫功能尚未成熟，病菌沿支氣管播散形成以小氣道周圍實(shí)變?yōu)樘卣鞯牟∽兗粗夤芊窝祝瑸閮和疭P 肺炎最常見的病理類型。本病一年四季均可發(fā)病，但以冬春季、氣候驟變時多見。SP 肺炎的病變?nèi)艟窒抻谝粋€肺葉或一個肺段而不擴(kuò)散為大葉性肺炎。年幼兒臨床表現(xiàn)常不典型，早期肺部體征不明顯，常見肺內(nèi)并發(fā)癥有膿胸、胸腔積液、肺膿腫，嚴(yán)重者出現(xiàn)膿毒癥甚至感染性休克。但SP肺炎與其他病原體如肺炎克雷白桿菌、肺炎桿菌肺炎、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、支原體肺炎等引起的肺炎的臨床表現(xiàn)無明顯特異性，需要病原學(xué)明確診斷［6］。

3.2 小兒SP 肺炎的病原學(xué)檢測 （1）涂片染色：SP 革蘭氏染色呈陽性球菌，菌體呈矛頭狀，成雙或短鏈狀排列，可快速獲得病原學(xué)依據(jù)。（2）病原體培養(yǎng)、分離：是呼吸道病原學(xué)檢測最常用的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不僅可鑒定是否為致病菌，還可行藥物敏感試驗(yàn)，指導(dǎo)抗菌素的準(zhǔn)確使用。但耗時長，檢出陽性率較低，不能作為早期診斷方法。（3）血清學(xué)檢測：包括免疫層析試驗(yàn)快速檢測SP 細(xì)胞壁上的多糖抗原和蛋白、酶聯(lián)免疫吸附測定SP 抗原和抗體，對SP 感染具有肯定的診斷價值［7］。（4）分子生物學(xué)：①聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），具有快速、特異性和靈敏度高、抗菌藥物影響少的優(yōu)勢，可用于早期診斷，SP 表面抗原A（psaA）是SP 的最佳識別指標(biāo)，實(shí)時熒光定量PCR 檢測SP 的LytA、psaA、ply 基因特定序列區(qū)，可提高靈敏度［8］。②莢膜腫脹試驗(yàn)：是SP肺炎分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但抗血清成本高，準(zhǔn)確性可能受抗血清的批次影響。③多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）：目前最常用的SP 分子分型方法之一，有利于發(fā)現(xiàn)基于莢膜多糖的傳統(tǒng)血清學(xué)不能分型或新出現(xiàn)的變異。④高通量測序技術(shù)（mNGS）：對同一樣本中的全部微生物DNA 先進(jìn)行高通量測序，再與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，具有高效、敏感，在危重癥、免疫缺陷、已用抗菌素及其他常規(guī)病原學(xué)檢測（-）的SP 肺炎中具有優(yōu)勢，且可同時檢測多種病原體。⑤全基因組測序（WGS）：可以鑒定細(xì)菌菌株是否為同一克隆，感染是否為暴發(fā)，可鑒定假定的疫苗靶標(biāo)。但耗時長，費(fèi)用貴，需特定的檢測工具。生物學(xué)檢測的最大缺點(diǎn)是不能明確檢測到的序列是否有生命特性，如何解讀檢測到的（+）結(jié)果。本研究中A 組采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、B 組采用多重PCR 和Luminex 懸浮態(tài)芯片技術(shù)進(jìn)行呼吸道病原體核酸檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B 組不僅SP 的陽性率明顯高于A 組，而且還發(fā)現(xiàn)了其他包括多種病毒、肺炎支原體、流感嗜血桿菌等的病原體，明顯提高了兒童肺炎的病原體檢出率。其原因可能是：SP 極易分泌多種自溶酶，若不及時送檢可影響檢驗(yàn)結(jié)果；采集痰標(biāo)本為侵入性操作，小兒依從性差，加大了病原菌檢測難度，不利于對呼吸道感染病原菌的精準(zhǔn)診斷。另外，A 組檢驗(yàn)結(jié)果的時間也明顯長于B 組，提示B 組檢測SP 的效率顯著高于A 組。

3.3 小兒SP 肺炎的治療 正確應(yīng)用抗菌素治療小兒SP肺炎至關(guān)重要。但臨床上目前無快捷SP 肺炎的病原學(xué)檢測方法，常在缺乏病原學(xué)前先采用經(jīng)驗(yàn)性治療，再根據(jù)臨床療效、肝腎心等器官功能、血象、病原學(xué)及藥敏等調(diào)整抗菌策略，以達(dá)到精準(zhǔn)治療目的。治療小兒SP 感染引起的肺炎首選青霉素類抗菌藥物，并根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和是否有并發(fā)癥確定給藥途徑和劑量。當(dāng)病情可能迅速惡化時，醫(yī)生還將使用耐藥性較低的其他抗菌素，以便在沒有細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果且沒有藥敏試驗(yàn)的情況下盡快控制病情［9］。綜上所述，與常規(guī)SP 痰培養(yǎng)相比較，對小兒SP 肺炎患兒使用多重PCR 和Luminex 懸浮態(tài)芯片技術(shù)進(jìn)行呼吸道病原體核酸檢測，不僅可為臨床醫(yī)生提供更多病原學(xué)依據(jù)，而且高效、快速，便于在經(jīng)驗(yàn)治療的基礎(chǔ)上加快調(diào)整至目標(biāo)正確治療，提高抗生素的合理使用率和治療有效率，改善預(yù)后，但檢測費(fèi)用稍貴，建議臨床推廣應(yīng)用。