腺病毒介導(dǎo)NAMPT過表達(dá)對酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及機(jī)制研究

周 萌 段超勤 陳志榮

酒精性脂肪性肝病(AFLD)是指由于長期大量飲酒導(dǎo)致的以肝細(xì)胞脂肪性病變?yōu)橹鞯囊活惣膊　＝陙?，隨著中國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活方式和飲食習(xí)慣發(fā)生了巨大改變，由酒精性肝損傷發(fā)展而來的酒精性肝病的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，AFLD為酒精性肝病的早期階段，對其開展研究十分必要[1-2]。NF-κB是參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要因子，抑制其表達(dá)可改善由乙醇誘導(dǎo)的肝損傷[3]。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)在人體的肝臟、骨骼和肌肉組織中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞的代謝、凋亡方面具有重要作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)NAMPT可下調(diào)NF-κB表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)[6-7]。由此推測，NAMPT可能通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而改善AFLD。本文探究了NAMPT對AFLD的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本研究選取45只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SYXK(遼)2018-0014，保持室溫為(25±2)℃，相對濕度為(55±10)%，12 h的晝、夜循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 動(dòng)物模型與分組

45只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，給予0.9%氯化鈉溶液，進(jìn)食普通飼料，持續(xù)8周。其余35只大鼠給予乙醇灌胃，采用每3天升高乙醇5%體積分?jǐn)?shù)的方式逐漸從30%增高至55%，同時(shí)進(jìn)食高脂飼料。造模21 d后，隨機(jī)抽取5只大鼠，采用H-E染色和油紅O染色觀察大鼠肝臟病理變化，判斷AFLD大鼠模型是否構(gòu)建成功。然后將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、空載體組、過表達(dá)NAMPT組，每組10只。其中空載體組大鼠在第1、5周于尾靜脈注射200 μL Ubi-EGFP(空載體)，過表達(dá)NAMPT組大鼠在第1、5周于尾靜脈注射200 μL NAMPT慢病毒載體[8-9]。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)法判斷NAMPT是否成功過表達(dá)。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測

第8周末，各組大鼠禁食不禁水12 h后，摘眼球取血，分離血清，測定肝臟質(zhì)量，然后取肝組織進(jìn)行組織勻漿。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中ALT、AST水平，試劑盒均購自美國Bio-Swamp公司。

1.4 肝臟組織病理變化

采用H-E染色法觀察大鼠肝臟組織病理變化，采用油紅O染色法觀察大鼠肝臟組織脂肪沉積情況。將固定于4%多聚甲醛溶液中的肝臟組織取出，石蠟包埋切片，之后進(jìn)行H-E染色和油紅O染色，觀察切片。

1.5 肝臟組織中mRNA相對表達(dá)量檢測

采用real-time qPCR法檢測各組大鼠肝臟組織中NAMPTmRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA相對表達(dá)量。取大鼠肝臟組織，液氮研磨后加入適量的TRIzol試劑提取RNA，使用PrimeScriptTMRT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的RNA的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參。引物由沈陽鼎國生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.6 肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平。使用裂解液提取組織總蛋白，利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后加入適量的上樣緩沖液，沸水浴變性，進(jìn)行電泳。電泳完畢后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。兔源抗NF-κB、TNF-α單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗為山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1∶2 000)，ECL顯色。應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件計(jì)算半定量蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的相對表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般體征和肝臟指數(shù)比較

空白組大鼠的皮毛光滑，行動(dòng)活躍，體質(zhì)量增長較快。造模各組大鼠皮毛暗淡，活動(dòng)減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，造模后2周內(nèi)食欲減退，體質(zhì)量降低，隨后呈緩慢增長趨勢。與空白組比較，模型組、空載體組和過表達(dá)NAMPT組的肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組的肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST的表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組、空載體組和過表達(dá)NAMPT組血清中ALT、AST表達(dá)水平均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組血清中ALT、AST表達(dá)水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中ALT、AST的表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠肝臟組織的病理變化

光學(xué)顯微鏡下可見，空白組大鼠肝臟組織中，各層結(jié)構(gòu)完整，組織連續(xù)、排列規(guī)則，無明顯脂質(zhì)沉積；模型組和空載體組大鼠的肝臟各層結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，組織與腺體形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤，有大量脂質(zhì)沉積；與空白組比較，過表達(dá)NAMPT組大鼠病理變化不明顯，表現(xiàn)為肝臟各層有些許愈合，排列相對整齊，僅可見少量的炎性細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)沉積。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理圖像 H-E染色 ×400 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達(dá)NAMPT組

圖2 各組大鼠肝臟組織病理圖像 油紅O染色 ×400 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達(dá)NAMPT組

2.4 各組大鼠肝臟組織中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA相對表達(dá)量比較

與空白組比較，模型組和空載體組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達(dá)量較低，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達(dá)量較高，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相對表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA水平比較

2.5 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組、空載體組肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對表達(dá)量均較高，過表達(dá)NAMPT組肝臟組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白相對表達(dá)量均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α的蛋白質(zhì)印跡圖 A 空白組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達(dá)NAMPT組

表5 各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α蛋白水平比較

3 討論

AFLD是酒精性肝病的早期階段，主要是由于乙醇和代謝產(chǎn)生的氧化物通過多種途徑直接或間接損傷肝臟所致[10-11]。本研究采用乙醇灌胃并給予進(jìn)食高脂飼料的方式構(gòu)建AFLD大鼠模型，通過觀察大鼠癥狀、體征、肝臟指數(shù)及病理切片可知，AFLD模型構(gòu)建成功。real-time qPCR法檢測結(jié)果可知，過表達(dá)NAMPT組肝臟組織中NAMPTmRNA相對表達(dá)量高于模型組和空載體組，這提示NAMPT過表達(dá)造模成功。本研究結(jié)果表明，與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組大鼠的肝臟指數(shù)降低，肝臟病理損傷明顯減輕，這提示過表達(dá)NAMPT有助于改善AFLD。

NAMPT作為內(nèi)臟脂肪素，可以抑制多種炎性因子表達(dá)，參與機(jī)體炎性反應(yīng)和代謝紊亂[12-13]。NAMPT可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平，并通過調(diào)控單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的分化、極化和遷移等參與炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展[14]。此外，研究表明NAMPT可通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-12和MMP-13的表達(dá)參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15]。另有研究表明，抑制NAMPT表達(dá)會靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1/MAPKα/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，加重由高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性[16]。

NF-κB在調(diào)控人體炎性反應(yīng)中扮演著重要角色[17]。研究表明，炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染性休克、病毒感染等均與NF-κB的調(diào)控失衡有關(guān)，且NF-κB激活的同時(shí)會促使TNF-α表達(dá)升高[18-20]。本研究通過檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α的mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與空白組比較，模型組、空載體組和過表達(dá)NAMPT組NF-κBmRNA及蛋白、TNF-αmRNA的相對表達(dá)量均較高；與模型組和空載體組比較，過表達(dá)NAMPT組NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均較低。以上結(jié)果提示，過表達(dá)NAMPT可下調(diào)NF-κB和TNF-α的水平，從而抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，過表達(dá)NAMPT可抑制AFLD大鼠的炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB、TNF-α的表達(dá)水平有關(guān)。因此，NAMPT有望成為臨床治療AFLD的新靶點(diǎn)，展現(xiàn)出了具有前景的應(yīng)用價(jià)值。