NRG4在克羅恩病組織中的表達(dá)及意義

朱良潤(rùn) 宋麗亞 張 楠

克羅恩病(CD)在歐美國(guó)家中發(fā)病率較高，近年來(lái)在中國(guó)CD的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[1]。CD是一種病因尚未完全闡明的慢性消化道炎性疾病，主要的臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、腹痛、腹部包塊及肛周病變等[2-3]。CD患者的臨床表現(xiàn)差異較大，常見(jiàn)表現(xiàn)為緩解和復(fù)發(fā)交替，部分患者可發(fā)生消化道大出血、腸梗阻、腸瘺或腸穿孔等并發(fā)癥，甚至需接受腸切除手術(shù)治療[4]。因此，盡早了解CD活動(dòng)度及患者預(yù)后情況，密切觀察并積極治療，對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要意義。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(NRG4)是一種含有表皮生長(zhǎng)因子類似區(qū)域的蛋白，可與表皮生長(zhǎng)因子受體ErbB4特異性結(jié)合，具有刺激細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等生理學(xué)功能[5-6]。研究顯示，NRG4可通過(guò)調(diào)控Src通路抑制壞死性小腸結(jié)腸炎腸上皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)腸道功能恢復(fù)[7]。此外，NRG4與ErbB4特異性結(jié)合后可通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，拮抗由TNF-α和干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡[8]?；谏鲜鲅芯浚茰y(cè)NRG4參與了CD的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程，檢測(cè)其水平有助于了解CD活動(dòng)度及患者預(yù)后情況。本文探究了NRG4在CD組織中的表達(dá)水平及臨床意義，以期為評(píng)估CD的病情及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年4月至2019年10月在青島市第三人民醫(yī)院就診的97例CD患者作為研究對(duì)象，設(shè)為CD組；另選擇同期行結(jié)直腸鏡檢查并切除息肉的63例患者作為對(duì)照組。根據(jù)《中國(guó)炎癥性腸病組織病理診斷共識(shí)意見(jiàn)》[9]診斷CD并進(jìn)行治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為CD；(2)接受結(jié)直腸鏡檢查；(3)年齡18～70歲；(4)能配合完成相關(guān)檢查；(5)簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并除CD外其他自身免疫性疾?。?2)就診前接受過(guò)抗炎藥物治療；(3)肝、腎功能不全；(4)合并惡性腫瘤；(5)未定期復(fù)診。CD組中男性53例，女性44例，年齡27～62歲，平均年齡為(44.02±7.26)歲；對(duì)照組中男性37例，女性26例，年齡30～55歲，平均年齡為(42.67±5.45)歲。兩組患者在年齡(t=1.266，P=0.207)、性別(χ2=0.260，P=0.610)方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 鏡下活動(dòng)度

采用CD簡(jiǎn)化內(nèi)鏡評(píng)分(SES-CD)評(píng)價(jià)CD活動(dòng)度[10]。將腸道分為末端回腸、右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、左半結(jié)腸和直腸，分別從潰瘍大小、潰瘍面積、累及腸段的面積和腸腔狹窄這4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，單項(xiàng)評(píng)分為0～3分，評(píng)分越高表示病情越嚴(yán)重。SES-CD評(píng)分≤3分為CD緩解期，SES-CD評(píng)分≥4分為CD活動(dòng)期。CD活動(dòng)期細(xì)分為輕度、中度、重度，其中輕度CD指4分≤SES-CD評(píng)分≤10分，中度CD指11分≤SES-CD評(píng)分≤19分，重度CD指SES-CD評(píng)分≥20分。

1.3 治療方案及近期預(yù)后評(píng)估

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018年，北京)》[11]對(duì)CD患者進(jìn)行治療。所有患者給予常規(guī)治療，包括營(yíng)養(yǎng)支持，糾正水、電解質(zhì)平衡紊亂，保護(hù)腸道黏膜及調(diào)節(jié)腸道菌群等。此外，根據(jù)患者病情給予糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或生物制劑等。

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2018年，北京)》[11]評(píng)估患者預(yù)后情況。臨床緩解指CD患者臨床癥狀消失，經(jīng)結(jié)直腸鏡檢查顯示潰瘍、炎性反應(yīng)均有好轉(zhuǎn)或克羅恩病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)評(píng)分<150分；早期復(fù)發(fā)指治療3個(gè)月內(nèi)，經(jīng)藥物治療進(jìn)入緩解期后，CD相關(guān)癥狀再次出現(xiàn)，且相關(guān)炎性指標(biāo)及結(jié)直腸鏡檢查結(jié)果顯示有疾病活動(dòng)的證據(jù)，或CDAI評(píng)分升高幅度>70分。

1.4 CD組織中NRG4的表達(dá)水平檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CD組織中NRG4的表達(dá)水平[12]。將RIPA裂解液滴至裝有CD組織的試管中裂解組織細(xì)胞，4 ℃ 4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，提取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。凝膠電泳80 V 15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面，之后轉(zhuǎn)膜、PBS洗膜。滴加兔抗人NRG4單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，次日滴加二抗，室溫孵育1 h。使用ELC發(fā)光液顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NRG4在CD組織中的表達(dá)

CD組中NRG4的相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.18，低于對(duì)照組(1.51±0.25)，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.632，P<0.001)。

2.2 NRG4與CD活動(dòng)度的關(guān)系

在97例患者中，輕度CD患者25例(25.77%)，中度CD患者43例(44.33%)，重度CD患者29例(29.90%)，分別設(shè)為輕度組、中度組和重度組。輕度組、中度組和重度組NRG4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.12、0.76±0.13和0.56±0.15，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.120，P<0.001)。其中，輕度組NRG4的表達(dá)水平高于中度組和重度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.710、13.075，P<0.05)；中度組NRG4的表達(dá)水平高于重度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=8.874，P<0.05)。CD患者NRG4的表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.598，P<0.001)。NRG4診斷中、重度CD患者的ROC曲線下面積(AUC)為0.844(95%CI：0.756～0.909)，最大約登指數(shù)為0.561，其所對(duì)應(yīng)的最佳截?cái)嘀怠⒚舾卸群吞禺惗确謩e為0.76、68.06%和88.00%，見(jiàn)圖1。

圖1 NRG4診斷中、重度CD患者的ROC曲線

2.3 NRG4與CD早期復(fù)發(fā)的關(guān)系

97例CD患者經(jīng)治療后有69例(71.13%)臨床緩解(設(shè)為未復(fù)發(fā)組)，其余28例(28.87%)復(fù)發(fā)(設(shè)為早期復(fù)發(fā)組)。兩組在年齡、性別、疾病類型、病變位置、C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)及首次治療使用激素方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與未復(fù)發(fā)組比較，早期復(fù)發(fā)組合并肛周病變的比例較高，NRG4的表達(dá)水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表1。NRG4診斷CD早期復(fù)發(fā)的AUC為0.952(95%CI：0.889～0.985)，最大約登指數(shù)為0.785，其所對(duì)應(yīng)的最佳截?cái)嘀?、敏感度和特異度分別為0.61、85.71%和92.75%，見(jiàn)圖2。以P<0.10為入選標(biāo)準(zhǔn)，將疾病類型、肛周病變和NRG4作為自變量，將早期復(fù)發(fā)作為因變量納入多因素logistic回歸模型，結(jié)果顯示疾病類型為穿透型[OR=3.702(95%CI：1.845～5.891)，P=0.010]、合并肛周病變[OR=1.948(95%CI：1.224～4.007)，P=0.005]是CD早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，NRG4[OR=0.208(95%CI：0.105～0.591)，P<0.001]是CD早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。

圖2 NRG4診斷CD早期復(fù)發(fā)的ROC曲線

表1 兩組的基本資料比較

3 討論

不同地區(qū)、人種的CD發(fā)病率和臨床特征存在一定差異[13]。CD的發(fā)病原因尚未完全明確，目前多認(rèn)為與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)[14]。盡早明確CD的病因?qū)τ谂R床診治具有重要意義。研究顯示，CRP和ESR判斷CD活動(dòng)度具有一定價(jià)值，但兩者的敏感度較低，且ESR的特異度也較低[15]。因此，仍需探究敏感度和特異度均較高的生物標(biāo)志物以準(zhǔn)確判斷CD活動(dòng)度。

NRG4基因位于人類染色體15q24，其蛋白主要表達(dá)于棕色脂肪組織[16]。已有研究表明，NRG4具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、抑制肝細(xì)胞脂代謝等作用[17-19]。研究顯示，NRG4與上皮細(xì)胞相關(guān)疾病關(guān)系密切，如NRG4可通過(guò)調(diào)控Src通路抑制壞死性小腸結(jié)腸炎腸上皮細(xì)胞凋亡[7]，并可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗由TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡[8]。由此推測(cè)，NRG4在CD組織中特異性表達(dá)，參與了CD的發(fā)病及進(jìn)展，檢測(cè)其水平可了解腸上皮黏膜細(xì)胞的凋亡情況。

本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CD組織和腸息肉組織中NRG4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CD組織中NRG4的表達(dá)水平低于腸息肉組織，提示NRG4的表達(dá)水平可能與CD的發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)。本研究比較了輕度、中度、重度CD患者的NRG4表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨CD活動(dòng)度加重，CD組織中NRG4的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，且NRG4的表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)NRG4參與了CD的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程。本研究構(gòu)建了NRG4診斷中、重度CD活動(dòng)度的ROC曲線，結(jié)果顯示其診斷的AUC、敏感度和特異度分別為0.844、68.06%和88.00%，這提示NRG4對(duì)CD活動(dòng)度的判斷具有較高價(jià)值，但敏感度較低。

CD反復(fù)發(fā)作可誘發(fā)消化道大出血、腸瘺、腸梗阻、腸穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，必要時(shí)需采取腸切除手術(shù)治療[20]。即使接受了腸切除手術(shù)治療，仍有部分CD患者術(shù)后復(fù)發(fā)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[21]。CD臨床緩解與復(fù)發(fā)交替不僅會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥，還會(huì)增高癌變風(fēng)險(xiǎn)[22]，若能及時(shí)了解復(fù)發(fā)情況，密切觀察并采取有效的干預(yù)措施，可大幅降低CD預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。本研究構(gòu)建了NRG4診斷CD早期復(fù)發(fā)的ROC曲線，結(jié)果顯示其診斷CD早期復(fù)發(fā)的AUC、敏感度和特異度分別為0.952、85.71%和92.75%，這提示CD組織中NRG4的表達(dá)水平對(duì)于評(píng)估CD患者的近期預(yù)后具有較高價(jià)值，有助于及時(shí)采取有效的干預(yù)措施以避免CD復(fù)發(fā)。為進(jìn)一步明確NRG4與CD早期復(fù)發(fā)的關(guān)系，本文采用多因素logistic回歸方法分析了影響CD患者治療后早期復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，結(jié)果顯示疾病類型為穿透型、合并肛周病變是CD早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，NRG4是CD早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素。

綜上所述，NRG4在CD組織中呈低表達(dá)。CD組織中NRG4的表達(dá)水平越低，提示患者病情越嚴(yán)重，CD早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也越高。檢測(cè)CD組織中NRG4的表達(dá)水平有助于了解患者的CD活動(dòng)度和近期預(yù)后情況，便于及時(shí)采取針對(duì)性治療，從而改善預(yù)后。本研究的不足之處在于隨訪時(shí)間較短，下一步研究將延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，以明確NRG4的表達(dá)水平對(duì)于CD患者遠(yuǎn)期預(yù)后的診斷價(jià)值。