胃癌患者的CD1D基因甲基化異化及其臨床意義

宋 健 袁桂紅 陳昭偉 黎 萍 王發(fā)保 胡飛翔 張榮琳 王俞雅

胃癌在中國惡性腫瘤發(fā)病率中居第2位，病死率居第1位[1]。目前尚無有效的早期診斷方法，診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍是胃鏡檢查，由于胃鏡檢查的依從性、可行性及社會經(jīng)濟(jì)效益比不理想，故不能作為胃癌篩查及早期診斷的有效方法[2]。目前亟需尋找到新的無創(chuàng)性且敏感度和特異度較高的胃癌診斷方法。近年來腫瘤特異的DNA甲基化分子靶標(biāo)成為研究的熱點，美國FDA在2014年已批準(zhǔn)結(jié)腸癌特異性的甲基化診斷試劑盒應(yīng)用于臨床，取得了較好的診斷效果[3]。然而，胃癌特異性的甲基化分子靶標(biāo)方面的研究不多，尚未發(fā)現(xiàn)可用于臨床的甲基化分子靶標(biāo)[4-5]，近年來研究通過甲基化基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，CD1D基因在胃癌患者中呈高甲基化狀態(tài)[6]，但其能否作為胃癌診斷的分子靶標(biāo)尚未見文獻(xiàn)報道。本文針對胃癌、慢性非萎縮性胃炎及慢性萎縮性胃炎患者的病理組織及胃液中CD1D基因甲基化水平進(jìn)行研究，旨在探討CD1D基因甲基化異化作為胃癌診斷分子靶標(biāo)的可能性，以及胃液能否作為其檢測標(biāo)本，以期為胃癌的早期診斷及預(yù)后評估提供策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例入組及標(biāo)本取材 本研究選擇2017年1月至2018年8月海南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心診治的77例胃癌及慢性胃炎患者，其中男性40例，女性37例，年齡35～75歲，平均年齡(56.28±13.85)歲。胃癌組37例，包含早期胃癌15例和進(jìn)展期胃癌22例。慢性胃炎患者40例，分為慢性非萎縮性胃炎組(20例)和慢性萎縮性胃炎組(20例)。胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)原發(fā)性胃癌診療指南(2017.V1)》[7]，胃炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國慢性胃炎共識意見(2017年，上海)》[8]。所有患者在入組前均未接受放射治療、化學(xué)治療及生物免疫治療，并排除患有其他系統(tǒng)腫瘤、其他胃腸疾病及其他器官衰竭的患者。入組患者胃鏡活組織檢查標(biāo)本及胃液標(biāo)本的留取及保存參照既往文獻(xiàn)[9]，胃癌患者取胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本(距離腫瘤邊緣>5 cm)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意?；颊叩囊话阗Y料見表1，各組年齡、性別之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 患者的一般情況比較

1.1.2 儀器和試劑 LG16-WA型離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)，DYY-6C型凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)，MG96+型PCR擴(kuò)增儀(杭州郎基科學(xué)儀器有限公司)，SC805型凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)。DNA甲基化亞硫酸鹽修飾試劑盒：EZ DNA Methylation-GoldTMKit(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.D5005)；DNA甲基化PCR擴(kuò)增試劑盒：ZymoTaq PreMix(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.E2003)；快速DNA提取試劑盒：Quick-DNATMUniversal Kit(美國Zymo Research公司，Catalog Nos.D4068)。

1.2 方法

1.2.1 各組胃組織及胃液DNA的提取 將各組胃活組織樣本保存在DNA保護(hù)劑中，提取DNA。將各組胃液于4 ℃離心10 min(1 000 r/min)，取上清液再次于4 ℃離心20 min(10 000 r/min)，留取沉淀物用于DNA抽提。采用快速DNA提取試劑盒，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。DNA純度分析采用核酸蛋白分析儀，采用凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.2.2 DNA的亞硫酸鹽修飾 將各組胃組織及胃液DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，采用DNA甲基化亞硫酸鹽修飾試劑盒，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。針對修飾前后的序列差異，采用MethPrimer軟件設(shè)計甲基化及非甲基化PCR擴(kuò)增引物，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.2.3 甲基化特異性PCR 將修飾后的各組DNA進(jìn)行甲基化特異性PCR(MSP)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)采用DNA甲基化PCR擴(kuò)增試劑盒，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃，預(yù)變性5 min，循環(huán)體系94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，之后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用雙蒸水作為空白對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例(%)表示，采用卡方檢驗、Mann-Whitney U 檢驗及Fisher′s精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理組織中CD1D基因甲基化水平比較

各組病理組織中CD1D基因MSP電泳結(jié)果見圖1。慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組及癌旁組CD1D基因甲基化異化率分別為25.0%(5/20)、35.0%(7/20)、86.5%(32/37)、56.8%(21/37)。胃癌組的病理組織中CD1D基因甲基化異化率與慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、癌旁組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，慢性非萎縮性胃炎組與萎縮性胃炎組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早期胃癌與進(jìn)展期胃癌患者的胃癌組織中CD1D基因甲基化異化率分別為66.7%(10/15)、100.0%(22/22)，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組胃組織中CD1D基因MSP電泳結(jié)果 A 慢性非萎縮性胃炎組 B 慢性萎縮性胃炎組 C 胃癌組 D 癌旁組

2.2 各組胃液中CD1D基因甲基化水平比較

各組胃液中CD1D基因MSP電泳結(jié)果見圖2。慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組的胃液DNA中CD1D基因甲基化異化率分別為0(0/20)、5.0%(1/20)、54.1%(20/37)，胃癌組較前兩者升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，慢性非萎縮性胃炎組與慢性萎縮性胃炎組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早期胃癌與進(jìn)展期胃癌患者的胃液中CD1D基因甲基化異化率分別為33.3%(5/15)、68.2%(15/22)，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組胃液中CD1D基因MSP電泳結(jié)果 A 慢性非萎縮性胃炎組 B 慢性萎縮性胃炎組 C 胃癌組

2.3 胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與臨床病理特征的關(guān)系

相關(guān)性分析顯示，胃癌患者的胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與胃癌臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 胃癌組織中CD1D基因甲基化異化與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

DNA甲基化異化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，目前在部分腫瘤的診斷及預(yù)后評估中具有較高的臨床價值[10]。DNA甲基化在胃癌中的相關(guān)研究較多[11-14]，但目前尚未見明確可靠的甲基化分子靶標(biāo)用于胃癌診斷的文獻(xiàn)報道。CD1D基因是CDl家族中的成員，在B細(xì)胞亞群、胸腺細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞亞群中表達(dá)豐富，CDl分子是獨立于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子之外的一類特殊的抗原遞呈分子[15]，它遞呈的抗原主要為脂質(zhì)分子，供NKT細(xì)胞識別，在免疫調(diào)節(jié)、NKT細(xì)胞發(fā)育、感染性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[16-20]。2018年Anderson等[6]的研究通過兩個中心全基因組甲基化基因芯片篩查及胃癌蠟塊組織驗證，發(fā)現(xiàn)CD1D基因在胃癌中呈高甲基化狀態(tài)，兩個中心診斷胃癌的AUC分別為0.94(95%CI：0.88～0.99)、0.91(95%CI：0.84～0.98)，敏感度分別為89%(95%CI：0.73～0.97)、86%(95%CI：0.73～0.94)。但因其驗證的病理組織樣本量較小，兩個中心的胃癌蠟塊組織分別為35例、36例，未在真實病例中進(jìn)行研究，故該研究結(jié)果仍需進(jìn)一步研究證實。此外，CD1D基因在食管癌中的甲基化異化情況尚未見文獻(xiàn)報道[21]，其是否具有胃癌特異性仍需進(jìn)一步研究明確。

胃液中含有大量胃黏膜脫落細(xì)胞及其DNA，易于獲取，是進(jìn)行胃癌分子診斷的良好標(biāo)本，通過胃管法獲取胃液進(jìn)行胃癌分子靶標(biāo)的檢測，對于人群的胃癌篩查具有更高的依從性和社會經(jīng)濟(jì)效益比。2016年Yamamoto等[22]的研究顯示，胃液可用作胃癌甲基化異化分子靶標(biāo)的檢測標(biāo)本。

本研究探討了CD1D基因在胃癌患者的胃癌和癌旁組織，慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎患者的病理組織，以及3類患者的胃液中的甲基化異化情況，并分析了CD1D基因甲基化異化與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，胃癌患者的胃癌組織及胃液DNA中CD1D基因啟動子區(qū)均呈高甲基化狀態(tài)，有較高的一致性，CD1D基因甲基化異化在胃癌早期即有發(fā)生。在慢性非萎縮性和慢性萎縮性胃炎患者中有少量CD1D基因甲基化異化發(fā)生，兩組均與胃癌組差異顯著。在胃癌組織中CD1D基因甲基化異化率高達(dá)86.5%，癌旁組織中的甲基化異化率也較高(56.8%)，發(fā)生甲基化異化的機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果提示CD1D基因甲基化異化具有潛在的作為胃癌診斷的分子靶標(biāo)的可能。CD1D基因在萎縮性胃炎患者病理組織中的甲基化異化率為35%，提示CD1D甲基化異化可能對胃癌的發(fā)生有一定的預(yù)警作用。本研究的相關(guān)性分析顯示，胃癌患者胃癌組織中CD1D基因啟動子區(qū)甲基化異化與腫瘤的分期相關(guān)，分期越晚則甲基化異化率越高，而與年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無顯著相關(guān)性。

綜上所述，CD1D基因在胃癌組織中呈高甲基化狀態(tài)，并且在早癌胃癌中即有較高的甲基化異化率，檢測胃液中CD1D基因甲基化異化情況有助于胃癌風(fēng)險的預(yù)測及早期診斷，CD1D基因甲基化異化具有潛在的成為胃癌診斷分子靶標(biāo)的可能，但仍需進(jìn)一步研究驗證并建立特異性的高效檢測方法。