食管鱗癌中CD137L表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移和微血管密度的相關(guān)性

安秀英 胡鋒超 張 晶 王 萍 竇 艷 張華英

食管鱗癌是指食管上皮鱗狀細(xì)胞分化的惡性上皮性腫瘤，占食管癌95%，其發(fā)病率和病死率均較高，具體病因不明，可能與遺傳、飲食習(xí)慣、抑癌機(jī)制缺陷等有關(guān)，目前治療方式包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療及免疫治療等[1-2]。CD137配體(CD137L)通過(guò)控制T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡、殺傷毒性等達(dá)到抗腫瘤的效果，已成為食管鱗癌免疫治療的研究熱點(diǎn)[3-4]。CD105是獨(dú)立存在于細(xì)胞表面的腫瘤新生血管的重要標(biāo)志物[5]。雖然學(xué)者們已經(jīng)開(kāi)展了CD137/CD137L靶向治療、腫瘤微血管密度(MVD)等的研究[6-7]，但在食管鱗癌中CD137L蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及MVD的相關(guān)性方面鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究比較了80例食管鱗癌患者的鱗癌組織和癌旁正常組織中CD137L、CD105蛋白的表達(dá)并分析CD137L表達(dá)與MVD的相關(guān)性，探討CD137L表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及MVD的意義，為免疫治療研究、食管腫瘤進(jìn)展機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2018年6月在河北省民政總醫(yī)院外科住院手術(shù)的80例食管鱗癌患者的食管鱗癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)進(jìn)行回顧性分析。男性45例，女性35例，年齡18～75歲，平均年齡為(57.38±6.94)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次就診，未經(jīng)其他治療；(2)未見(jiàn)食管以外的腫瘤病灶；(3)經(jīng)病理檢查確診為食管鱗癌，病理切片可見(jiàn)角質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞之間存在細(xì)胞間橋，或伴有角化珠，患者腫瘤組織均存于本院病理科；(4)溝通交流無(wú)障礙。

1.2 方法

1.2.1 定量PCR檢測(cè) 組織裂解后制備成勻漿，提取總RNA，制備實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR(qPCR)檢測(cè)。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min變性，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)食管鱗癌組織及癌旁正常組織中CD137LmRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，以2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所有操作步驟均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 組織切片制備與觀察 食管鱗癌組織和癌旁正常組織用4%中性甲醛固定4～6 h，組織經(jīng)常規(guī)處理，包埋，切片，展平，烤片。光鏡下復(fù)閱石蠟切片，重新診斷。記錄腫瘤臨床病理特征，包括組織學(xué)分級(jí)(Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí))，浸潤(rùn)深度(黏膜內(nèi)、肌層、外膜)，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，由兩位病理醫(yī)師判定結(jié)果。組織學(xué)分級(jí)參照《安徽省食管癌分級(jí)診療指南(2016版)》[8]：(1)Ⅰ級(jí) 癌細(xì)胞分裂有層次，癌巢中有明顯角化珠、細(xì)胞內(nèi)角化、發(fā)育良好的細(xì)胞問(wèn)橋；(2)Ⅱ級(jí) 癌細(xì)胞分界尚清，癌巢周邊核呈柵狀排列，有細(xì)胞內(nèi)角化及個(gè)別角化珠；(3)Ⅲ級(jí) 癌細(xì)胞大小不等，細(xì)胞間橋不明顯，核異型性明顯，核分裂多伴壞死。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色與各指標(biāo)檢測(cè) 每例蠟塊連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)食管鱗癌組織及癌旁正常組織中CD137L、CD105蛋白的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。依據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占比，分為陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)，由兩位病理醫(yī)師判定結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)黃色或棕黃色顆粒。每例切片在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比計(jì)分(每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞)：<5%計(jì)0分；>5%且≤25%計(jì)1分；>25%且≤50%計(jì)2分；>50%且≤75%計(jì)3分；>75%計(jì)4分。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色程度計(jì)分：無(wú)著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；褐黃色計(jì)3分。5個(gè)視野得分取均值，兩種得分相乘得出免疫組織化學(xué)評(píng)分(IHS)：0～1分為陰性表達(dá)；2～12分為陽(yáng)性表達(dá)。MVD計(jì)算：4倍光鏡下選擇3個(gè)CD105蛋白表達(dá)熱區(qū)，于10倍光鏡下計(jì)數(shù)CD105標(biāo)記的微血管，取3個(gè)視野的均值作為MVD值[3,5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的CD137LmRNA、CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。不同臨床病理特征的食管鱗癌組織中CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)。兩種組織中MVD比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson法分析食管鱗癌組織中CD137LmRNA表達(dá)量與MVD的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩種組織中CD137L mRNA和蛋白表達(dá)比較

采用qPCR法檢測(cè)80例食管鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的CD137LmRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中的CD137LmRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中CD137L蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜，少量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 兩種組織中的CD137L mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖1 兩種組織中的CD137L蛋白表達(dá)病理圖 免疫組織化學(xué)染色SP法 ×400 A 食管鱗癌組織 B 癌旁正常組織

2.2 食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

如表3所示，浸潤(rùn)深度越深，則CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表3 食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 兩種組織中MVD比較

采用CD105標(biāo)記MVD，免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，CD105蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，食管鱗癌組織中的MVD顯著高于癌旁正常組織[(36.92±6.55)/mm2比(10.17±2.12)/mm2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.002，P=0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩種組織中CD105標(biāo)記的MVD病理圖 免疫組織化學(xué)染色SP法 ×400 A 食管鱗癌組織 B 癌旁正常組織

2.4 食管鱗癌組織中CD137L表達(dá)與MVD的相關(guān)性

比較食管鱗癌組織中CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者的MVD，結(jié)果顯示前者的MVD顯著低于后者[(31.94±6.13)/mm2比(41.77±6.08)/mm2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相對(duì)表達(dá)量與MVD的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD137LmRNA相對(duì)表達(dá)量與MVD呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.492，P=0.000)。

3 討論

食管癌是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，在中國(guó)，其發(fā)病率居惡性腫瘤第9位，病死率居惡性腫瘤第4位，惡性程度較高[9]。國(guó)外研究顯示多數(shù)食管癌為腺癌[10]，而國(guó)內(nèi)研究顯示95%的食管癌為鱗癌[11]，國(guó)內(nèi)外食管癌組織來(lái)源的不同可能與國(guó)內(nèi)外人群遺傳差異、飲食習(xí)慣不同等因素相關(guān)。雖然目前對(duì)食管癌患者采用以手術(shù)為主，輔以化學(xué)治療、放射治療、中藥治療及對(duì)癥治療等治療方式，但其5年生存率仍低于40%[8,12]。近年來(lái)開(kāi)展了針對(duì)性較強(qiáng)的免疫治療，其機(jī)制為激活免疫調(diào)節(jié)分子增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的免疫因子又稱為協(xié)同刺激分子[13-14]，相關(guān)研究表明CD28/B7均為重要的協(xié)同刺激分子，而CD137為目前較新的研究熱點(diǎn)，CD137L為CD137的配體，表達(dá)于多數(shù)實(shí)體腫瘤細(xì)胞上，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織中CD137L低表達(dá)和不表達(dá)是腫瘤免疫逃逸的機(jī)制之一[15-17]。CD137與CD137L結(jié)合可刺激多條信號(hào)通路，激活免疫反應(yīng)，參與多種腫瘤的發(fā)生，如非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、食管癌等[18-19]。然而，相關(guān)研究中均未對(duì)食管鱗癌中CD137L表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移和MVD的相關(guān)性進(jìn)行闡述。因此，本研究通過(guò)比較80例食管鱗癌患者的鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中CD137L、CD105表達(dá)并分析CD137L表達(dá)與MVD的相關(guān)性，旨在探討CD137L表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及MVD的意義。

本研究采用qPCR法檢測(cè)80例食管鱗癌及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中CD137LmRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中CD137LmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中CD137L蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜，少量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，可觀察到黃色或棕黃色顆粒，CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織，其分子機(jī)制不明。研究表明，細(xì)胞膜表面蛋白與免疫因子結(jié)合是引起免疫清除的重要因素，腫瘤細(xì)胞膜表面蛋白通常不表達(dá)或低表達(dá)，以逃逸免疫監(jiān)視，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展階段具有重要意義[20]。本研究顯示，食管鱗癌組織中CD137LmRNA和蛋白的表達(dá)均低于癌旁正常組織，與該研究結(jié)論相符。

本研究分析了食管鱗癌組織中CD137L蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)深度越深，CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。浸潤(rùn)程度較深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示患者腫瘤分期較高，預(yù)后較差。本研究中結(jié)果提示CD137L蛋白低表達(dá)患者的預(yù)后較差，生存率較低。因此，可將CD137L作為判斷病情及預(yù)后的指標(biāo)。

研究表明MVD是評(píng)估腫瘤內(nèi)微血管形成的重要指標(biāo)。本研究中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CD105蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，食管鱗癌組織中MVD顯著高于癌旁正常組織(t=10.002，P=0.000)。腫瘤內(nèi)血管形成對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有重要意義。通常血管的豐富程度反映了腫瘤的發(fā)展速度，且血供越豐富，則腫瘤經(jīng)血液及淋巴轉(zhuǎn)移的可能性越大。因此，MVD也可作為判斷腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)。研究表明，MVD升高提示腫瘤內(nèi)新生血管增多，尤其是轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中血管增多，血供增加，腫瘤侵襲能力增強(qiáng)，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[21]。

CD137L表達(dá)越低預(yù)示腫瘤惡性程度越高，患者預(yù)后越差；MVD越高預(yù)示腫瘤侵襲能力越強(qiáng)，患者預(yù)后越差。本研究分析了食管鱗癌組織中CD137L表達(dá)與MVD的相關(guān)性，結(jié)果顯示CD137L蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的MVD顯著低于CD137L蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相對(duì)表達(dá)量與MVD的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD137L mRNA相對(duì)表達(dá)量與MVD呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.492，P=0.000)。機(jī)體免疫監(jiān)視的強(qiáng)度、腫瘤血供的豐富程度均為腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。CD137L表達(dá)與免疫監(jiān)視的強(qiáng)度相關(guān)，MVD是腫瘤微血管形成的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究表明CD137與CD137L結(jié)合后具有活化、刺激、趨向、增強(qiáng)T細(xì)胞的作用[15,20]。因此，CD137L蛋白陽(yáng)性與陰性表達(dá)患者的腫瘤MVD存在差異，且CD137LmRNA低表達(dá)、MVD高表達(dá)的患者預(yù)后不良。

綜上所述，食管鱗癌組織中CD137L主要表達(dá)在細(xì)胞膜，少量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。CD137L在食管鱗癌組織中呈低表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移及MVD密切相關(guān)，可為臨床免疫治療研究、食管腫瘤進(jìn)展機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。