8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2敲除鼠心肌纖維化的作用及機(jī)制

劉雨佳，白鵬云，張 磊，印 文

心肌纖維化可引起心肌僵硬、順應(yīng)性降低、收縮功能降低，從而降低了心臟功能。心肌的纖維化是引發(fā)心律失常的重要誘因，同時(shí)也是多種心血管疾病的共同病理過(guò)程。心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌組織中成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的膠原蛋白（Collagen）沉積過(guò)度[1]。心肌膠原蛋白以Ⅰ型和Ⅲ型為主。Ⅰ型膠原蛋白（Colla‐genⅠ）較粗，抗?fàn)坷芰?qiáng)，保持室壁的強(qiáng)度，約占心肌膠原總數(shù)的85%；Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）較細(xì)，由于其較強(qiáng)的彈性和伸展性，在維持室壁的彈性方面起重要作用，在總膠原比例中約11%。心肌纖維化發(fā)生的分子基礎(chǔ)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面是膠原蛋白排列紊亂以及各型膠原蛋白比例失衡，另一方面是膠原蛋白表達(dá)水平異常增高[2]。研究證實(shí)，合成基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是降解ECM的關(guān)鍵酶，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TⅠMPs）通過(guò)抑制MMP活性來(lái)調(diào)節(jié)其功能。在正常心肌組織中，MMPs和TⅠMPs維持著動(dòng)態(tài)平衡，一旦MMPs和TⅠMPs比例失調(diào)，將會(huì)引起心肌纖維化的發(fā)生[3]。

研究[4]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是誘發(fā)心肌纖維化的重要機(jī)制。體內(nèi)活性氧（ROS）和抗氧化系統(tǒng)比例失衡引起氧化應(yīng)激，ROS可以激活MMP，進(jìn)而增加膠原纖維的生成和沉積，從而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展[5‐6]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor‐erythroid 2p45‐related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中承擔(dān)中樞調(diào)節(jié)作用，在多種疾病過(guò)程中起保護(hù)作用。在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1（Keleh‐like ECH‐associat‐ed protein l）解離，從而被活化，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相結(jié)合，啟動(dòng)多種抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)醌氧化還原酶（NQO1）、血紅素加氧酶1（HO‐1）等酶的生成。這些酶可以與細(xì)胞內(nèi)多余的自由基發(fā)生反應(yīng)，從而解除細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。Nrf2在防治心肌纖維化過(guò)程中的重要作用在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[8‐10]。

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)多種疾病的防治都呈現(xiàn)出有益的效果。有研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善心肌纖維化，進(jìn)而增強(qiáng)心肌功能[11‐12]。而有氧運(yùn)動(dòng)改善心肌纖維化的機(jī)制仍不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可激活骨骼肌內(nèi)Nrf2，進(jìn)而上調(diào)了抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化功能。而有氧運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)Nrf2途徑改善心肌纖維化？目前仍不明確。本研究以Nrf2敲除鼠為基礎(chǔ)，建立有氧運(yùn)動(dòng)模型，以探討Nrf2在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)心肌纖維化中的作用。

1 研究方法

1.1 研究對(duì)象

20只Nrf2基因敲除小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，8周齡，并采用同周齡野生型C57BL/6J小鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司）20只作為對(duì)照，根據(jù)基因型隨機(jī)分為野生安靜組（WC）、野生運(yùn)動(dòng)組（WE）、敲除安靜組（KC）和敲除運(yùn)動(dòng)組（KE），每組10只。動(dòng)物飼養(yǎng)房?jī)?nèi)溫度控制在22～24℃，室內(nèi)濕度維持在40%～60%，全天24 h自然燈光照明，不限制飲食飲水，采用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采用小動(dòng)物跑臺(tái)跑步的形式。在正式訓(xùn)練前，WE組和KE組小鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練，坡度為0°，跑速為12 m/min（約75%最大攝氧量強(qiáng)度[13]），1次/天，每次15 min，共5次。正式訓(xùn)練采用相同跑速，5次/周，60 min/次，共8周。WC組和KC組小鼠不訓(xùn)練，籠中正?；顒?dòng)。

1.2 取材

所有取材距最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均間隔至少48 h。小鼠脫頸椎處死，打開(kāi)胸腔，取小鼠心臟，采用生理鹽水沖洗后稱(chēng)量重量，然后用錫紙包裹，標(biāo)記并立刻投入液氮冷凍。然后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 全心質(zhì)量指數(shù)測(cè)定

取材后的心臟進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)（全心重/體重×100）。

1.4 Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)

將2.2中凍存的心肌組織置于離心管，加入的RⅠ‐PA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑。將心肌剪碎后，高速勻漿；4℃靜置30 min，然后4℃下12 000 rpm離心30 min，取上清液備用。蛋白濃度采用BCA試劑盒測(cè)定。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算蛋白上清液體積，以20μg作為每次電泳的總蛋白量。按照常規(guī)操作進(jìn)行電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠（SDS‐PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h。加入用0.01 mol/L TBST稀釋的一抗（Nrf2，1：200；CollagenⅠ，1：200；CollagenⅢ，1：200；MMP2，1：200；TⅠMP2，1：200；NQO1，1：500；HO‐1，1：1 000；GAPDH，1：500），室溫脫色搖床上搖動(dòng)孵育1 h，4℃孵育過(guò)夜；0.01 mol/LTBST漂洗3次，二抗孵育1 h。再次TBST漂洗3次，然后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，通過(guò)熒光水平計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。研究中運(yùn)動(dòng)干預(yù)和基因型的主效應(yīng)和雙因素交互效應(yīng)采用雙因素方差分析。如果主效應(yīng)不顯著，干預(yù)方式或同種基因型單因素作用采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 各組小鼠取材時(shí)全心質(zhì)量指數(shù)

各組小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)前體重?zé)o顯著性差異，干預(yù)后取材時(shí)的體重、心臟重量和全心重量指數(shù)如表1所示，KC組小鼠體重顯著低于WC組，而其余各組間無(wú)顯著性差異。各組的心臟重量和全心重量指數(shù)無(wú)顯著性差異。

表1 各組小鼠取材時(shí)的體重、心臟重量和全心重量指數(shù)Table1 Body Weight，Heart Weight，and Heart Weight/Body Weight Index in Each Group

2.2 各組小鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)

各組小鼠Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白的表達(dá)如圖1和表2所示，與WC組相比，KC組CollagenⅠ表達(dá)顯著增加，而KE組CollagenⅠ表達(dá)顯著高于KE組，但野生型小鼠和Nrf2敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)組與各自的安靜組間均沒(méi)有顯著性差異。CollagenⅢ蛋白表達(dá)在各組間均無(wú)顯著性差異。

圖1 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)Figure1 The Expression of CollagenⅠand CollagenⅢ

表2 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)Table 2 The Expression of CollagenⅠand CollagenⅢ

2.3 各組小鼠MMP2和TIMP2蛋白的表達(dá)

如圖2和表3所示，KC組MMP2表達(dá)顯著高于WC組，KE組TⅠMP2表達(dá)顯著高于WE組。與WC組相比，KC組TⅠMP2的表達(dá)顯著增加，而KE組顯著高于WE組。MMP2/TⅠMP2如表3所示，KC組和KE組分別較野生鼠的同種干預(yù)方式組顯著升高，而同種基因型小鼠在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后并沒(méi)有呈現(xiàn)顯著性差異。

圖2 MMP2和TIMP2蛋白表達(dá)Figure2 The Expression of MMP2 and TIMP2

表3 各組小鼠的MMP2、TIMP2和MMP2/TIMP2Table3 The Expression of MMP2，TIMP2，and MMP2/TIMP2.

2.4 各組小鼠Nrf2的蛋白表達(dá)

各組小鼠心肌Nrf2的蛋白表達(dá)如圖3和表4所示，與WC組相比，WE組顯著增加，而KC組顯著減少；KE組顯著低于WE組，而KE組和KC組間無(wú)顯著性差異。

圖3 各組小鼠Nrf2蛋白表達(dá)Figure3 The Expression of Nrf2 in Each Group

表4 各組小鼠Nrf2蛋白的表達(dá)Table4 The Expression of Nrf2 in Each Group

2.5 各組小鼠心肌抗氧化酶的表達(dá)

通過(guò)對(duì)抗氧化酶NQO1和HO‐1的蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除鼠NQO1和HO‐1蛋白表達(dá)均顯著低于野生鼠的同種干預(yù)組，而有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增加了野生鼠HO‐1的蛋白表達(dá)，而對(duì)于Nrf2敲除鼠無(wú)明顯效果（見(jiàn)圖4、表5）。

圖4 各組小鼠NQO1和HO-1蛋白表達(dá)Figure4 The Expression of NQO1and HO-1 in Each Group

表5 各組小鼠NQO1和HO-1蛋白表達(dá)Table5 The Expression of NQO1and HO-1 in Each Group

3 分析討論

通過(guò)對(duì)Nrf2敲除鼠膠原蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的缺失引起了膠原蛋白含量的紊亂，以Ⅰ型膠原蛋白的含量增多為主，Ⅰ/Ⅲ膠原纖維比例失調(diào)。S.A.CAⅠ等人[8]的研究證實(shí)葛根素通過(guò)激活Nrf2，減輕了心肌纖維化；鳶尾素同樣通過(guò)激活Nrf2，抑制了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的氧自由基（ROS）生成，減緩了心肌纖維化的進(jìn)程[9]；積雪草酸通過(guò)Nrf2/HO‐1和TGF‐β1/Smads信號(hào)通路抑制了自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化[10]；L.LⅠ等人[14]的結(jié)果顯示，Nrf2激活可以通過(guò)抑制TGF‐β1/Smad3通路的激活改善心肌纖維化。這些結(jié)果均證明，Nrf2的激活可以改善心肌纖維化。本研究結(jié)果顯示Nrf2的缺失直接影響了膠原蛋白的比例，從而影響了心肌纖維化的進(jìn)程。

MMP2/TⅠMP2是導(dǎo)致心肌纖維化的可能機(jī)制，可作為判斷心肌纖維化的標(biāo)準(zhǔn)。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，MMP2與心肌纖維化的程度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Nrf2敲除鼠的MMP2表達(dá)增加，且MMP2/TⅠMP2顯著高于野生鼠。這一結(jié)果可能是由于Nrf2的缺失導(dǎo)致心肌內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)失衡所引起的。A.D.KANDASAMY[5]等人的研究證實(shí)了MMP2可以受到氧化應(yīng)激的激活，從而引起心肌損傷。L.DANG等人[16]研究也認(rèn)為，ROS的生成是誘發(fā)MMP2表達(dá)增多的關(guān)鍵因素。ROS同時(shí)又促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。炎癥反應(yīng)與心肌纖維化存在著密切的關(guān)系[17]。炎癥細(xì)胞在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，大量分泌ⅠL‐1β、TNF‐α和TGF‐β1等一系列炎癥因子和促纖維化因子，成纖維細(xì)胞受到刺激而增殖，ECM的合成增強(qiáng)。如果ECM進(jìn)一步的積聚，則促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生[18]。ROS可以通過(guò)作用于TGF‐β1/Smad通路促進(jìn)ECM的沉積進(jìn)而加重心肌纖維化[19]。Nrf2與纖維化的多項(xiàng)研究也呈現(xiàn)出與本研究相似的結(jié)果。Nrf2敲除鼠較野生鼠呈現(xiàn)出增多的MMP2表達(dá)和炎癥反應(yīng)，并且Nrf2在調(diào)節(jié)ECM降解過(guò)程中具有保護(hù)作用[20]；Y.GUAN等人[21]證實(shí)了Nrf2通過(guò)ROS/TGF‐β1/Smad途徑抑制了腸纖維化；Nrf2通過(guò)使ROS失活，降低了ROS對(duì)TGF‐β1的作用，從而在減輕器官纖維化過(guò)程中起保護(hù)作用[22]。因此綜合推測(cè)，Nrf2的敲除引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的失衡，ROS生成以及炎性反應(yīng)增加，刺激了心肌內(nèi)膠原蛋白紊亂，與心肌纖維化相關(guān)的MMPs/TⅠMPs比例失衡，從而促進(jìn)了心肌纖維化的進(jìn)程。

研究結(jié)果顯示有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)心肌Nrf2的表達(dá)，且有氧運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)下游抗氧化酶HO‐1的表達(dá)。而對(duì)于Nrf2敲除鼠，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)抗氧化酶的作用并不顯著，由此說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)HO‐1的激活是Nrf2依賴(lài)性的。S.S.GOUNDER等人[23]通過(guò)6周中等強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了青年小鼠心肌Nrf2的表達(dá)，抗氧化酶NQO1、HO‐1和過(guò)氧化氫酶（CAT）表達(dá)也增加，并且有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練同樣增強(qiáng)了老年小鼠心肌Nrf2的表達(dá)，抗氧化酶CAT和谷胱甘肽還原酶表達(dá)受到有氧運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)；M.SUN等人[24]采用8周中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)了SD大鼠心肌Nrf2的作用，NQO1、CAT和SOD表達(dá)增加；有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老心肌Nrf2和抗氧化系統(tǒng)的增強(qiáng)效果也得到了證實(shí)[25]。這些都與本研究結(jié)果相一致。有研究證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善心肌纖維化的進(jìn)程。X.XU等人[26]研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)可以可改善MMPs和TⅠMPs之間的平衡，減輕了心肌纖維化并維持心肌梗死后的心臟功能；N.MA等人[27]通過(guò)對(duì)老年大鼠進(jìn)行12周中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)通過(guò)增強(qiáng)心肌H2S的生物活性改善了衰老引起的心肌纖維化；L.XⅠAO等人[28]采用間歇性的研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以抑制TGFβ通路，導(dǎo)致心肌組織纖維化和瘢痕形成減少；P.H.LⅠAO等人[29]采用游泳的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式同樣證明了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以減輕衰老引起的大鼠心臟的心臟炎癥，肥大和纖維化損傷；尹懿等人[30]在高血壓模型中也證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善高血壓誘導(dǎo)的心肌纖維化；H.WANG等人[11]的研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過(guò)激活PGC‐1α和Akt通路改善了糖尿病模型小鼠的心肌纖維化；在肥胖小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌纖維化的顯著改善[31‐32]。在本研究中有氧運(yùn)動(dòng)并沒(méi)有顯著改善Nrf2敲除鼠的心肌纖維化，這說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌纖維化的作用可能對(duì)Nrf2具有依賴(lài)性，也可能有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nrf2缺失引起的心肌纖維化無(wú)顯著作用。因此，Nrf2在有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌纖維化的調(diào)節(jié)作用仍待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與建議

Nrf2的缺失能夠引起膠原蛋白紊亂和MMPs/TⅠMPs比例失衡，促進(jìn)小鼠心肌纖維化的進(jìn)程；有氧運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)Nrf2及其下游抗氧化酶表達(dá)，這一機(jī)制可能在有氧運(yùn)動(dòng)改善心肌纖維化過(guò)程中起決定性作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2通路在有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌纖維化的決定性作用，建議在今后的研究中通過(guò)構(gòu)建心肌纖維化的有氧運(yùn)動(dòng)模型，檢驗(yàn)Nrf2通路在其中的作用以確認(rèn)其作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步探索，為運(yùn)動(dòng)改善心肌纖維化提供充分依據(jù)。