酪氨酸激酶受體EphA1調(diào)控Snail2蛋白影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力

宋世賓，仇文進，肖祖沐，魏入廷，侯雨男，徐卡婭，陳益民

膠質(zhì)瘤是成人最常見和最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤，盡管在包括外科切除、術(shù)后放化療的標準治療方面取得了一定進展，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差[1]。膠質(zhì)瘤的侵襲性是治療的主要障礙[2-3]，其侵襲的機制仍不清楚。酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinase)能夠促進腫瘤的侵襲能力[4]，促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體(erythropoietin producing hepatoma cell line，Eph)家族是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的家族[5]。EphA1作為Eph家族中的一員在多種惡性腫瘤的侵襲及進展中發(fā)揮重要作用[6-7]，但EphA1是否在膠質(zhì)瘤進程中發(fā)揮作用鮮有報道。本研究旨在探討酪氨酸蛋白激酶受體EphA1對膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

正常星形膠質(zhì)細胞NHA獲贈于北京神經(jīng)外科研究所，人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251購買于美國模式培養(yǎng)細胞保育中心(ATCC)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購買于美國Gibco公司，RNA提取試劑Trizol Regent購買于Ambion公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購買于上海吉凱生物公司，兔抗人單克隆抗體一抗EphA1、Snail2、β-actin購買于美國CST公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購買于北京中山金橋公司，EphA1小干擾(EphA1-siRNA)購買于上海吉瑪生物公司，EphA1及GAPDH引物合成于上海生工生物公司，蛋白提取試劑盒及Western Blot 凝膠配制試劑盒購買于上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

正常星形膠質(zhì)細胞NHA、膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251培養(yǎng)，置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、5%CO2,每隔2～3 d傳代1次。細胞分組:陰性對照組 (轉(zhuǎn)染無意義RNA序列) 和實驗轉(zhuǎn)染組 (轉(zhuǎn)染EphA1小干擾RNA) 。按照上海吉凱生物公司說明書的方法在U87、U251細胞中進行EphA1的小干擾RNA和無意義序列的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測

Trizol試劑提取細胞中總RNA，分光光度計檢測RNA的濃度和質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄后加入EphA1及內(nèi)參GAPDH引物，EphA1上游引物5’-ATGGCACATACGAAACCC-3’，下游引物5’-ACCTCCCACATCACAATC-3’；GAPDH上游引物：5’-TCGACAGTCAGCCGCCGCATCT-3’，下游引物：5’-CCGTTGACTCCGACCTTCA-3’。設(shè)置qPCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。并按照2-ΔΔCt方法計算RNA的相對表達量。

1.2.3 細胞劃痕損傷修復(fù)實驗

每個細胞培養(yǎng)小皿中種植3×105個細胞，移液槍頭尖端在培養(yǎng)皿細胞層劃痕，PBS沖洗3 次，加入無血清培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、48 h拍照取樣，計算劃痕修復(fù)情況。

1.2.4 Western Blot實驗

提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并加入上樣緩沖液煮沸10 min，配制10% SDS-PAGE凝膠，每凝膠孔上樣40 μg 蛋白，80 V電泳分離蛋白，恒流300 mA、100 min濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，4 ℃一抗孵育過夜，常溫二抗孵育2 h，最后化學發(fā)光法曝光顯影。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 EphA1在膠質(zhì)瘤細胞中表達水平高于正常星形膠質(zhì)細胞

為明確EphA1在正常星形膠質(zhì)細胞(NHA)與膠質(zhì)瘤細胞U87、U251中的表達水平，通過qPCR實驗檢測正常星形膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤細胞U87、U251中EphA1的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞U87、U251中EphA1的mRNA表達水平高于正常星形膠質(zhì)細胞(圖1A，P<0.05)；通過Western Blot實驗檢測正常星形膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤細胞U87、U251中EphA1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞U87、U251中EphA1 蛋白表達水平高于正常星形膠質(zhì)細胞(圖1B，P<0.05)。

圖1 正常星形膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤細胞中EphA1的mRNA、蛋白表達水平。A：qPCR發(fā)現(xiàn)U87及U251細胞中EphA1的mRNA表達高于NHA細胞,**P<0.01 (n=3)，***P<0.001 (n=3)；B：Western Blot發(fā)現(xiàn)U87及U251細胞中EphA1的蛋白表達高于NHA細胞。

2.2 敲低EphA1可抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力

在膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中轉(zhuǎn)染EphA1小干擾RNA作為實驗轉(zhuǎn)染組，并以轉(zhuǎn)染無意義序列RNA作為陰性對照組，通過細胞劃痕損傷修復(fù)實驗評估敲低EphA1后對膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染EphA1小干擾RNA后膠質(zhì)瘤細胞U87(圖2A見封二，P<0.001)和U251(圖2B見封二，P<0.001)的細胞劃痕損傷48 h后修復(fù)能力明顯減弱，說明敲低EphA1表達后膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力減弱。

2.3EphA1調(diào)控Snail2蛋白表達影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力此外，通過Western Blot實驗檢測在膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中敲低EphA1表達對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標記蛋白的影響。與陰性對照組相比，在膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中轉(zhuǎn)染EphA1小干擾RNA后，EphA1蛋白表達水平顯著降低，敲低EphA1表達抑制了EMT標記蛋白Snail2表達水平(圖3見封二，P<0.05)。上述實驗表明EphA1小干擾RNA的敲低效果，并證實EphA1可能通過調(diào)控Snail2蛋白表達促進膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT，從而影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，盡管目前針對膠質(zhì)瘤的治療采取了手術(shù)切除腫瘤組織、術(shù)后輔助以放療化療方法，但是膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然不佳，尤其膠質(zhì)母細胞瘤患者中位生存期仍不足15個月[8]。膠質(zhì)瘤細胞的EMT增強了細胞的侵襲能力，膠質(zhì)瘤細胞廣泛侵入周圍正常腦組織區(qū)域造成腦組織結(jié)構(gòu)和功能嚴重受損，術(shù)后腫瘤周圍組織殘存的腫瘤細胞使得腫瘤快速復(fù)發(fā)，因此膠質(zhì)瘤細胞的高度侵襲性是其預(yù)后不佳的主要原因[2,9]，故急需探尋影響膠質(zhì)瘤侵襲能力的機制。

酪氨酸蛋白激酶受體家族(RTK)是一類酶聯(lián)受體，能夠與配體結(jié)合促使酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，可以調(diào)控基因的表達，在細胞的粘附、分化、遷移、增殖、生長及胚胎發(fā)育中發(fā)揮著作用，同時又可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生形成[10]。EphA1是促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體(Eph)家族中重要的一員，EphA1受體可以調(diào)控胚胎發(fā)育導(dǎo)致胚胎出生后出現(xiàn)差異性，并參與血管形成，借導(dǎo)神經(jīng)軸突的導(dǎo)向[11]，同時也調(diào)控腫瘤的發(fā)生形成[6]。已經(jīng)有相關(guān)文獻表明EphA1參與腫瘤的發(fā)生與進展，例如敲低EphA1表達能夠抑制卵巢癌的進程[12]，EphA1在食管鱗狀細胞癌中的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進展相關(guān)[13-14]，EphA1通過調(diào)整胃癌腫瘤微環(huán)境中VEGF、IL-6細胞因子來影響腫瘤血管新生和炎癥微環(huán)境,從而促進胃癌的發(fā)生和發(fā)展[15],EphA1的mRNA的表達水平在膀胱腫瘤組織中明顯高于正常組織,且與病理分級、臨床分期呈正相關(guān),EphA1能夠促進膀胱癌的進展[16]，小干擾RNA沉默EphA1受體對肝細胞癌具有抗血管生成和抗腫瘤作用[17]。但EphA1在已知的腫瘤類型中，并不全是腫瘤促進因子，研究表明EphA1在結(jié)直腸腫瘤中明顯下調(diào)，低表達的EphA1往往與結(jié)直腸腫瘤不良預(yù)后相關(guān)[18]；EphA1蛋白在正常腎小管細胞中表達明顯高于腎透明細胞癌，且EphA1蛋白表達水平與腎透明細胞癌核級有關(guān)[19]。

由于EphA1在不同腫瘤中具有促進或抑制腫瘤的作用，但目前鮮有關(guān)于EphA1在膠質(zhì)瘤中發(fā)生作用的報道。我們首先對比正常星形膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤細胞系中EphA1的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)EphA1在膠質(zhì)瘤細胞系中表達明顯高于正常星形膠質(zhì)細胞，說明EphA1在膠質(zhì)瘤中可能扮演促進作用。隨即通過細胞劃痕損傷修復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細胞系中下調(diào)EphA1表達能夠明顯減低細胞的侵襲能力。EMT賦予細胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，促進腫瘤發(fā)展[20-21]，因此我們懷疑膠質(zhì)瘤中EphA1是否通過影響腫瘤細胞EMT來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲能力？Snail2是一種已知調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，其失調(diào)與多種類型的癌癥有關(guān)[22-23]。我們研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞系中敲低EphA1表達能夠明顯抑制Snail2蛋白表達，說明EphA1可能靶向調(diào)節(jié)Snail2促進膠質(zhì)瘤的侵襲能力。

綜上所述，本研究證明了EphA1在膠質(zhì)瘤中的作用，并揭示了EphA1可能通過調(diào)控Snail2蛋白水平引起膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT，從而促進膠質(zhì)瘤的侵襲能力。這種新型EphA1/Snail2軸為膠質(zhì)瘤侵襲的機制提供了新的見解，靶向EphA1/Snail2可能是治療惡性膠質(zhì)瘤的潛在策略，本研究結(jié)果為日后阻斷膠質(zhì)瘤侵襲提供了一個新的潛在方法。