褪黑素對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗生長(zhǎng)及葉片水分生理的影響

佟莉蓉， 倪順剛， 任星遠(yuǎn)， 劉嘉欣， 聞 靜， 王 娟， 宋 雨

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

達(dá)烏里胡枝子(Lespedezadavurica)作為黃土高原優(yōu)質(zhì)的鄉(xiāng)土牧草，具有耐寒、耐旱和耐貧瘠等優(yōu)良特性，在恢復(fù)黃土高原天然草地植被、控制水土流失、促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)等方面具有重要作用，也可作為飼用、藥用和食用植物，具有較高的開發(fā)和利用價(jià)值[1-2]。干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物因素之一，不僅影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，也降低了植物的生產(chǎn)力，而達(dá)烏里胡枝子主要產(chǎn)地在干旱半干旱地區(qū)，極易受到干旱脅迫的影響，尤其是在對(duì)土壤水分利用能力較弱的幼苗階段[3]。因此，在苗期保障達(dá)烏里胡枝子幼苗免受干旱脅迫傷害顯得極為重要。

褪黑素(Melatonin，MT)又稱松果體素，廣泛分布于動(dòng)植物中，可通過影響多種代謝途徑來調(diào)節(jié)或增強(qiáng)植物抗逆性，可以緩解重金屬脅迫、干旱脅迫、低溫或高溫逆境對(duì)高等植物的損害[4]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以緩解逆境對(duì)黃瓜(Cucumissativus)[5]、番茄(Solanumlycopersicum)[6]、玉米(Zeamays)[7]和小麥(Triticumaestivum)[8]等植物幼苗帶來的傷害，促進(jìn)其生長(zhǎng)。大量研究表明，施用褪黑素不僅可以促進(jìn)種子萌發(fā)，促進(jìn)植物根系發(fā)育，還可保護(hù)葉綠素，延緩葉片衰老，增強(qiáng)植物抵御逆境脅迫[9-13]。但目前而言，褪黑素在牧草資源上的應(yīng)用研究較少。因此，本研究以鄉(xiāng)土牧草達(dá)烏里胡枝子幼苗為材料，通過分析幼苗階段的生長(zhǎng)狀況、水分特性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等方面，研究在干旱脅迫下不同濃度外源褪黑素對(duì)達(dá)烏里胡枝子幼苗生長(zhǎng)及葉片水分生理的影響，篩選最佳的施用濃度，以期為達(dá)烏里胡枝子的抗旱栽培提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種‘晉農(nóng) 1號(hào)’達(dá)烏里胡枝子為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院自主選育通過國(guó)審的新品種，生產(chǎn)年份為2017年，裸種千粒重約為2.215 g，種子含水量約11.26%。褪黑素(分析純)購(gòu)于南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

共設(shè)置7個(gè)處理，即WMT0(正常供水+0 μmol·L-1MT)，DMT0(干旱脅迫+0 μmol·L-1MT)，DMT1(干旱脅迫+25 μmol·L-1MT)，DMT2(干旱脅迫+50 μmol·L-1MT)，DMT3(干旱脅迫+100 μmol·L-1MT)，DMT4(干旱脅迫+ 200 μmol·L-1MT)和DMT5(干旱脅迫+400 μmol·L-1MT)，每個(gè)處理4次重復(fù)。

供試種子于6月24號(hào)播種于規(guī)格為15 cm×10 cm×15 cm(上徑×下徑×高)白色塑料花盆中，每盆裝基質(zhì)3.0 kg (培養(yǎng)基質(zhì)為沙土體積比1∶2的混合物，土壤pH值約為7.5，最大田間持水量為30.85%)。播種量為每盆30顆。為保障營(yíng)養(yǎng)供給，在生長(zhǎng)至第15 d后每盆間苗到15株，并澆灌一次200 mL 1/2霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液。在培養(yǎng)到第5周后開始進(jìn)行褪黑素噴施，連續(xù)3 d在傍晚噴施各處理相對(duì)應(yīng)的褪黑素(含適量吐溫-20作為葉片表面活化劑，增強(qiáng)葉片吸收褪黑素的能力)，葉片正面和反面均進(jìn)行噴施，噴施量以水滴剛好不下落為宜，WMT0和DMT0分別噴施等量蒸餾水。3 d的噴施處理完成后，每盆均澆水至最大田間持水量。澆足水后WMT0處理保持田間持水量的80%，其他組通過自然干旱法進(jìn)行15 d干旱處理，盆栽放置位置采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每隔5 d調(diào)換盆方向，確保各盆各面受光條件相同。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1鮮重 干旱脅迫處理完成后，每個(gè)處理隨機(jī)取5株植株用純水清洗并拭干，從根莖結(jié)合部將地上部和地下部分開，分別測(cè)定鮮重。

1.3.2水分指標(biāo) 分別在0，5，10 d和15 d取達(dá)烏里胡枝子葉片約0.2 g，清洗表面雜物，稱出鮮重，將葉片放入105℃烘箱中殺青15 min，之后放入80℃烘箱烘干至恒重，稱出干重，葉片鮮干比=鮮重/干重。另取5片達(dá)烏里胡枝子成熟葉片，稱出鮮重，浸入超純水中12 h后稱出飽和重，之后放入將葉片放入105℃烘箱中殺青15 min，之后放入80℃烘箱烘干至恒重，稱出干重。公式計(jì)算方法如下[14]：

葉片含水率(Leaf moisture content)=(鮮重—干重)/鮮重

葉片相對(duì)含水量(Leaf relative water content)=(鮮重—干重)/(飽和重—干重)

葉片水分飽和虧(Leaf water saturation deficit)=(飽和重—鮮重)/(飽和重—干重)

1.3.3滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 比色法測(cè)定；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，并用最小差異顯著法(Least significant difference，LSD)進(jìn)行多重比較，運(yùn)用Origin Version 2018進(jìn)行繪圖，所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗鮮重的影響

與WMT0處理相比，DMT0處理的地上部分、地下部分以及整體鮮重分別降低了41.27%，61.91%和55.72%(P<0.05)(圖1)，說明干旱脅迫限制了達(dá)烏里胡枝子幼苗的生長(zhǎng)；添加適宜濃度的外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗生長(zhǎng)有明顯的改善，其中DMT3處理效果最為顯著。與DMT0處理相比，DMT3處理下達(dá)烏里胡枝子地下部分、地上部分以及整體鮮重分別增加了44.62%，87.96%和70.70%，其中地上部分以及整體鮮重差異顯著(P<0.05)。結(jié)果顯示，葉面噴施一定濃度外源MT能有效緩解干旱脅迫對(duì)達(dá)烏里胡枝子幼苗地上部分的抑制現(xiàn)象，其中100 μmol·L-1MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好。

圖1 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗不同部位鮮重的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin on fresh weight of L. davurica seedlings in different part under drought stress注：圖中不同小寫字母代表不同處理同一指標(biāo)間差異顯著(P<0.05)。圖中WMT0代表正常水分處理，不進(jìn)行葉面噴施MT處理；DMT0代表干旱脅迫處理，不進(jìn)行葉面噴施MT處理；DMT1代表干旱脅迫處理并噴施25 μmol·L-1 MT；DMT2代表干旱脅迫處理并噴施50 μmol·L-1 MT；DMT3代表干旱脅迫處理并噴施100 μmol·L-1 MT；DMT4代表干旱脅迫處理并噴施200 μmol·L-1MT；DMT5代表干旱脅迫處理并噴施400 μmol·L-1 MT。下同Note:Different lowercase letters in the figure represent significant differences between different treatments at the 0.05 level. WMT0 represent non-drought treatment without MT;DMT0 represent drought treatment without MT;DMT1 represent drought treatment with 25 μmol·L-1 MT;DMT1represent drought treatment with 25 μmol·L-1 MT;DMT2 represent drought treatment with 50 μmol·L-1 MT;DMT3 represent drought treatment with 100 μmol·L-1 MT;DMT4 represent drought treatment with 200 μmol·L-1MT;DMT5represent drought treatment with 400 μmol·L-1 MT. The same as below

2.2 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗水分特性的影響

在持續(xù)的干旱脅迫下，達(dá)烏里胡枝子的葉片鮮干比、葉片相對(duì)含水量、葉片含水率呈持續(xù)降低趨勢(shì)，而葉片水分飽和虧缺呈持續(xù)升高趨勢(shì)(表1)。在干旱脅迫的前5 d，不同濃度外源MT處理下的葉片鮮干比、葉片相對(duì)含水量、葉片含水率和水分飽和虧缺與DMT0處理相比差異均不顯著。在干旱脅迫第15 d時(shí)，DMT2和DMT3的處理比DMT0處理的葉片鮮干比分別提升了15.81%和16.11%(P<0.05)；與DMT0處理比較，不同濃度外源MT處理下葉片相對(duì)含水量分別提升了3.87%，11.75%，16.30%，10.84%和0.99%，其中DMT3處理與DMT0處理存在顯著差異(P<0.05)；不同濃度外源MT處理下葉片水分飽和虧缺與DMT0處理比較，分別降低了8.10%，24.54%，34.10%，22.06%和2.07%，DMT3處理與DMT0處理差異顯著(P<0.05)?？傮w而言，MT處理雖然能提高干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子葉片鮮干比、葉片相對(duì)含水量和葉片含水率，但影響較小，其中100 μmol·L-1MT效果最明顯。

表1 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗葉片水分特性的影響Table 1 Effects of exogenous melatonin on leaf water characteristics of L. davurica seedlings under drought stress

2.3 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

在持續(xù)的干旱脅迫下，達(dá)烏里胡枝子葉片的可溶性糖、可溶性蛋白含量呈先升高后降低趨勢(shì)，游離脯氨酸含量則呈持續(xù)上升趨勢(shì)(圖3)。在干旱脅迫第5 d時(shí)，DMT2，DMT3和DMT4處理的可溶性糖含量與DMT0處理比較，增加了14.36%，25.27%和28.21%(P<0.05)；DMT3處理的可溶性蛋白含量與DMT0處理差異顯著(P<0.05)；DMT4和DMT5處理的游離脯氨酸含量與DMT0處理差異顯著(P<0.05)。在干旱脅迫第10 d時(shí)，DMT1和DMT3處理的可溶性糖含量與DMT0處理差異顯著(P<0.05)；DMT3，DMT4和DMT5處理的可溶性蛋白顯著高于DMT0處理(P<0.05)。在脅迫第15 d時(shí)，DMT2，DMT3和DMT4處理的可溶性糖含量較DMT0處理分別提高了53.82%，43.83%和29.10%(P<0.05)；不同濃度外源MT處理下的可溶性蛋白含量均顯著高于DMT0處理(P<0.05)；DMT2，DMT3和DMT5處理的游離脯氨酸含量與DMT0處理比較，分別提高了17.00%，28.68%和30.21%(P<0.05)。

圖2 外源MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on osmotic adjustment substances in leaves of L. davurica seedlings under drought stress

2.4 綜合評(píng)價(jià)

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法[16]對(duì)干旱脅迫末期(15 d)下不同濃度MT處理(DMT0，DMT1，DMT2，DMT3，DMT4和DMT5)對(duì)達(dá)烏里胡枝子的幾個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明(表2)，干旱脅迫下，外源MT處理的隸屬值均比未噴施MT效果要好，其中100 μmol·L-1MT噴施效果最佳。噴施效果順序依次為100 μmol·L-1>50 μmol·L-1>200 μmol·L-1>25 μmol·L-1>400 μmol·L-1>0 μmol·L-1MT。

表2 MT濃度對(duì)緩解達(dá)烏里胡枝子干旱脅迫效應(yīng)的綜合評(píng)價(jià)分析Table 2 Comprehensive evaluation of melatonin concentration on alleviating drought stress of L. davurica

3 討論

在自然環(huán)境條件下，干旱脅迫是重要的非生物逆境，它會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性增大，膜脂過氧化作用加劇，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致其代謝紊亂，加速其衰老和死亡[17]。而外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是緩解生物、非生物脅迫的一種方法，通過調(diào)控植物體內(nèi)多個(gè)生理生化進(jìn)程來直接或間接地提高植物的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗的地下部分、地上部分以及整體鮮重均受到顯著抑制，其中干旱脅迫對(duì)地上部分的抑制效果大于地下部分，該結(jié)論與Lemoine等[18]結(jié)論一致，其研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫對(duì)植物地上部分的傷害要顯著高于地下部分。前人研究認(rèn)為，施加一定濃度的MT均可對(duì)植物地上部和地下部的鮮重產(chǎn)生影響。鄒京南等[19]在對(duì)大豆的研究中也發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下葉面噴施褪黑素能明顯促進(jìn)地上部分鮮重的增加，而對(duì)地下部分鮮重影響較小，研究中認(rèn)為在大豆葉面噴施的褪黑素主要通過氣孔吸收，使其主要存在于葉片細(xì)胞中，通過維管束及篩管等運(yùn)輸途徑到地下部則較少。尉欣榮等[20]研究表明，在干旱與低溫脅迫下施加100 μmol·L-1濃度MT可以顯著提高多年生黑麥草幼苗鮮重并降低了相對(duì)電導(dǎo)率，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MT能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)和脯氨酸積累，有效地清除活性氧，從而緩解了多年生黑麥草的生長(zhǎng)抑制，增強(qiáng)了其抗寒和抗旱性。楊新元[21]研究也發(fā)現(xiàn)施加不同濃度MT可對(duì)干旱脅迫下向日葵幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，以濃度100 μmol·L-1促進(jìn)效果最佳。以上結(jié)論與本研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)100 mol·L-1的MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最好，其中對(duì)地上部分促進(jìn)作用較為明顯，原因可能是葉面噴施時(shí)，褪黑素主要通過氣孔吸收的方式存在于地上莖葉中，導(dǎo)致植物地上部細(xì)胞MT濃度增加，從而促進(jìn)了干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗的成長(zhǎng)。

植物葉片保水能力的強(qiáng)弱代表植物體內(nèi)耗散水分的高低，保水能力越強(qiáng)，植物耗散水分量也越少，這是植物自身對(duì)干旱的適應(yīng)選擇[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)烏里胡枝子葉片在干旱程度持續(xù)增加時(shí)，其葉片鮮干比、葉片含水率、葉片相對(duì)含水量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，相反，葉片水分飽和虧呈上升趨勢(shì)，在脅迫至第10 d和15 d時(shí)均與正常供水組差異顯著，說明干旱脅迫使達(dá)烏里胡枝子體內(nèi)水分含量減少，抑制了達(dá)烏里胡枝子幼苗的正常生長(zhǎng)。在楊樹[23]上的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加，楊樹苗葉片的相對(duì)含水量呈下降的趨勢(shì)，且脅迫越嚴(yán)重下降的幅度越大。MT可以調(diào)節(jié)干旱脅迫下植物對(duì)水分的利用能力，減緩干旱脅迫的傷害。在本研究中，外源MT處理對(duì)達(dá)烏里胡枝子的干旱效應(yīng)有一定的緩解作用，經(jīng)過MT處理后，達(dá)烏里胡枝子的葉片鮮干比、葉片含水率、葉片相對(duì)含水量均有不同程度的提升，葉片水分飽和虧呈下降趨勢(shì)。說明適宜濃度的MT可以提高干旱脅迫下植物水分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和保存能力，使植物有較強(qiáng)的抗旱性，其中以100 μmol·L-1MT濃度處理效果最好。鄒京南等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MT能提高干旱脅迫下大豆葉片相對(duì)含水量。馬樂元[15]則認(rèn)為一定濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)也可在干旱脅迫下促進(jìn)小冠花的水分調(diào)節(jié)能力，提高葉片鮮干比、葉片含水率、葉片相對(duì)含水量。羅興雨[24]也認(rèn)為施加100 μmol·L-1褪黑素能使燕麥葉片在干旱脅迫下維持較高的相對(duì)含水量，提高植物鮮重，減輕干旱對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制現(xiàn)象。因此，施加適宜濃度的外源MT可以提高達(dá)烏里胡枝子在干旱脅迫下植物保水能力，能使植物葉片有較高的水分，使植株有較高的抗旱性。

干旱脅迫下，細(xì)胞缺少水分，蛋白質(zhì)的多肽鏈逐漸分解，使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生極大的形變，蛋白質(zhì)降解為各類可溶性蛋白和游離態(tài)的氨基酸[25-26]。游離態(tài)脯氨酸和可溶性蛋白是生物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過在細(xì)胞內(nèi)累積大量的游離態(tài)脯氨酸和可溶蛋白，提高束縛水的含量，保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定，緩解干旱效應(yīng)[27]?？扇苄蕴侵饕ㄆ咸烟?、果糖等單糖類物質(zhì)，是呼吸作用的最主要的底物之一，是重要的碳源，與碳代謝緊密聯(lián)系在一起[28]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下脯氨酸含量持續(xù)升高，而可溶性糖和可溶性蛋白含量呈先升高后降低趨勢(shì)，說明在干旱后期達(dá)烏里胡枝子遭受到干旱脅迫的傷害，滲透調(diào)節(jié)能力減弱，該研究結(jié)論同Niknam等[29]在煙草(Nicotianatabacum)上的研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)外源施加一定濃度MT可以有效提高達(dá)烏里胡枝子在干旱脅迫下游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量，這與劉月等[30]在大豆的結(jié)果和王芳等[31]在玉米上的結(jié)果相一致。原因可能是外源MT減緩了膜脂過氧化，維持了細(xì)胞膜蛋白和原生質(zhì)體的穩(wěn)定，在干旱后期使植物體內(nèi)還有較高的游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，而高含量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)又能提高植物的保水能力，防止細(xì)胞脫水，減緩了干旱脅迫帶來的傷害。

本研究通過葉面噴施的方式來探究干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)MT可以顯著促進(jìn)地上部的生長(zhǎng)，但通過地下部灌根的方式進(jìn)行處理是否會(huì)影響到地下部的生長(zhǎng)還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，MT作為一個(gè)內(nèi)源植物激素，不僅調(diào)控植物逆境下的生理生化活動(dòng)，也可以影響到多種激素代謝過程，本研究雖通過施加外源施加MT對(duì)干旱脅迫下達(dá)烏里胡枝子的水分生理及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MT可以改善逆境下達(dá)烏里胡枝子的水分狀況，但就褪黑素是否還可以調(diào)控植物的光合作用或是活性氧代謝等生理活動(dòng)，或是調(diào)控抗逆基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步影響到達(dá)烏里胡枝子體內(nèi)其他內(nèi)源激素含量還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

與干旱對(duì)照相比，施加適宜濃度的外源MT可顯著提高達(dá)烏里胡枝子的鮮重、葉片鮮干比、葉片相對(duì)含水量、可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量，并降低水分飽和虧缺，表明外源褪黑素可促進(jìn)苗期植物的抗旱性。通過模糊隸屬函數(shù)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，提高達(dá)烏里胡枝子幼苗抗旱性的外源MT最佳濃度為100 μmol·L-1。