藏北燕麥草地持續(xù)利用與撂荒對高寒草甸土壤特征的影響

王明濤， 方江平， 包賽很那， 苗彥軍， 王向濤， 趙玉紅， 謝文棟， 倉木德吉

(1.西藏高原生態(tài)研究所， 西藏 林芝 860000； 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院， 西藏 林芝 860000；3.那曲市草原站， 西藏 那曲 852000； 4.西藏那曲市申扎縣農(nóng)牧科技服務(wù)站， 西藏 那曲 852000)

藏北那曲地區(qū)草地面積約0.42億hm2，占那曲地區(qū)總面積的86.40%[1]。該區(qū)域是西藏畜牧業(yè)重要的生產(chǎn)基地，天然草地生產(chǎn)力較低導(dǎo)致該區(qū)域飼草匱乏，建植人工草地提高優(yōu)質(zhì)飼草產(chǎn)量是解決當(dāng)前飼草供需矛盾的重要舉措[2]。

已有研究結(jié)果表明，隨著種植年限的增加，種植人工草地能夠有效的增加土壤有機質(zhì)含量并促進(jìn)土壤有機碳的形成，土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀、有機碳、全氮、全磷含量較原生草地明顯升高[3]。燕麥(AvenasativaL.)是禾本科燕麥屬一年生作物，具有抗旱、耐寒、耐貧瘠等特點，在高寒牧區(qū)復(fù)雜多變的氣候下燕麥具有較好的適應(yīng)能力，已是青藏高寒牧區(qū)不可替代的飼草品種[4]。相關(guān)研究顯示以燕麥建植一年生人工草地可顯著提升草地生產(chǎn)力，緩解天然草地放牧壓力，由于不同地域及自然條件的差異導(dǎo)致建植燕麥人工草地對土壤理化性質(zhì)影響不同，土壤因子的變化將對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性產(chǎn)生重要的影響[5-7]。土壤微生物通過自身的生長代謝活動與其它植物、動物或非生物因素相互協(xié)調(diào)、相互作用調(diào)節(jié)土壤的養(yǎng)分及循環(huán)過程，進(jìn)而影響植物的生長和植被群落結(jié)構(gòu)特征[8]。因此，土壤微生物數(shù)量、群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)等是評價其所在生態(tài)系統(tǒng)是否健康與穩(wěn)定的幾個重要指標(biāo)[9-11]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在不同的土地利用方式、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子相關(guān)性等方面做了大量的研究工作[12-14]。

藏北高寒地區(qū)受生長季短暫、缺氧、溫度低、紫外線強烈等因素的限制，適宜種植栽培的牧草種類極少，人工草地建植草種多以一年生牧草為主[15]。到目前為止，有關(guān)高寒草甸建植人工草地對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落影響的研究報道較少。鑒于此，我們選擇藏北高寒草甸類草地上建植的一年生燕麥人工草地為研究對象，通過與鄰近天然草地的對比，分析長期利用近21 a的一年生燕麥人工草地、撂荒近21 a的一年生燕麥人工草地與鄰近天然草地土壤理化性質(zhì)和土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，以期為高寒草甸草地人工草地的持續(xù)合理利用、開發(fā)及高寒草甸生態(tài)建設(shè)與保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地自然概況

西藏自治區(qū)那曲市位于青藏高原腹地，區(qū)域面積為42萬km2，占西藏自治區(qū)總面積的1/3，海拔4 500 m以上；屬于高原亞寒帶季風(fēng)氣候區(qū)，高寒缺氧、氣候干燥、輻射強，全年大風(fēng)日數(shù)100 d左右，年平均氣溫-2.2℃，年最低氣溫達(dá)-28.6℃，最高氣溫為21.9℃；年降水量400 mm左右，降水主要集中在5-9月份；全年日照時數(shù)2 886 h以上，無絕對無霜期[16-17]。天然草地主要植被有高山嵩草(KobresiapygmaeaC.B.Clarke)，釘柱委陵菜(PotentillasaundersianaRoyle)，黑苞風(fēng)毛菊(SaussureamelanotricaHand.-Mazz)，紫花針茅(StipapurpureaGriseb)，青海刺參(MorinakokonoricaHao)，狼毒(StellerachamaejasmeLinn.)，圓齒皺龍膽(Gentianacrenulatotruncata(Marp.)T.N.Ho)，青藏雪靈芝(ArenariaroborowskiiMaxim)，毛果草(Lasiocaryummunroi(C.B.Clarke)Johnst.)，梭羅草(KengyiliaYen et J.L.Yang)等。

1.2 試驗方法

1.2.1樣地設(shè)置與樣品采集 試驗于2019年8月植物生長旺季進(jìn)行，通過走訪當(dāng)?shù)刈簦c草原主管部門相關(guān)人員對人工草地種植年限、種植面積等進(jìn)行信息核實，確定了3種試驗樣地連續(xù)建植21 a一年生燕麥人工草地(Artificial grassland，AG)，每年6月份種植，播種量約240 kg·hm-2，翻耕深度約15 cm，施底肥磷酸二胺為150 kg·hm-2，有灌溉措施；一年生燕麥撂荒草地(Abandoned cultivation grassland，AC)，建植時播種與管理方式與AG相近，一次收獲牧草后撂荒至今，無人為管理措施，撂荒后與鄰近天然草地相一致；鄰近天然草地作為對照樣地(Natural grassland，NG)(表1)。

表1 試驗樣地基本信息Table 1 Basic information of the test site

樣地土壤樣品采集用內(nèi)徑5 cm土鉆，按“V”字形路線取樣間距2 m，取樣土層為0～10 cm，一部分土樣帶回實驗室置于通風(fēng)處，干燥后去除植物根系、碎石和殘體等雜物，磨碎后過0.25 mm篩，用四分法取土樣0.5 kg，重復(fù)3次，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)的測定。另一部分土樣用車載冰箱帶回實驗室用-80℃低溫冰箱保存，以供測試土壤微生物使用。

1.2.2土壤理化性質(zhì)測定 土壤理化性質(zhì)指標(biāo)的測定采用常規(guī)分析方法[18]。土壤容重采用環(huán)刀法測定；土壤含水量采用烘干稱重法測定；土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定；土壤pH值用酸度計電位法測定；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定；土壤全鉀含量采用原子吸收-火焰光度計法測定；土壤速效氮含量采用堿解擴散法測定；土壤速效鉀含量采用原子吸收-火焰光度計法測定。

1.2.3土壤細(xì)菌高通量測定 利用高通量測序技術(shù)方法對3個樣地共計9份草地土壤樣品的細(xì)菌菌群V3-V4區(qū)進(jìn)行測序，累積獲得664 111條有效序列，各樣品平均有效序列數(shù)為73 790條。土壤樣品總DNA提取使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒，利用引物(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)獲得細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4高變異區(qū)。擴增經(jīng)產(chǎn)物回收純化，采用Illumina公司TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。由于MiSeq測序讀長有限制，同時也為了保證測序質(zhì)量，選定最佳測序的插入片段范圍是200～450 bp。Illumina HiSeq測序分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。QIIME2軟件計算微生物Alpha多樣性，數(shù)據(jù)制圖使用R軟件(R package)繪制主成分分析圖(Principal component analysis，PCA)，RDA分析圖用Canoco 5.0完成[19-20]。

2 結(jié)果分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

表2顯示0～10 cm土層，人工草地土壤有機質(zhì)、全鉀含量和pH與天然草地?zé)o顯著差異，土壤全氮、速效氮和速效鉀含量顯著低于天然草地(P<0.05)。與天然草地相比，撂荒草地土壤pH顯著升高，土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮和速效鉀含量顯著降低(P<0.05)。

表2 土壤理化性質(zhì)比較分析Table 2 Comparative analysis of soil physical and chemical properties

2.2 土壤細(xì)菌多樣性

隨著測序數(shù)量的增加，樣品中物種的觀察指數(shù)稀釋曲線逐漸上升，斜率減小，表明樣品大多數(shù)菌群被覆蓋，可足夠反映樣品中絕大部分細(xì)菌物種的信息。如圖1所示，人工草地(AG)共檢測到OTU數(shù)10 217個，撂荒草地(AC)OTU數(shù)為8 809個，天然草地(NG)OTU數(shù)為8 736個。OTU數(shù)由大到小排序為：人工草地(AG)>撂荒草地(AC)>天然草地(NG)。

圖1 不同樣地稀疏曲線與韋恩圖Fig. 1 Rsrefaction curves and venn diagram analysis in different sampling sites

人工草地細(xì)菌群落豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和均勻度指數(shù)顯著高于天然草地(P<0.05)。撂荒草地細(xì)菌群落豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和均勻度指數(shù)與天然草地?zé)o顯著差異，人工草地和撂荒草地的系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)與天然草地?zé)o顯著性差異(表3)。由PCA分析(圖2)可知，3個樣地的9個樣本能夠很好的區(qū)分，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成存在明顯的差異。

表3 不同樣地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析Table 3 Analysis of bacterial diversity index in different sampling sites

圖2 不同樣地細(xì)菌組成PCA分析Fig. 2 PCA analysis of different bacterial composition

2.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

注釋結(jié)果顯示，各樣地細(xì)菌門水平組成中放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、已科河菌門(Rokubacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Patescibacteria和消化螺菌門(Nitrospirae)等10個菌門占總相對豐度的近98%，其余菌門相對豐度低于1%，共占近2%。前3個菌門的相對豐度均大于10%，占總豐度的近78%，是不同樣地細(xì)菌群落中的優(yōu)勢菌門。如圖3所示，對比天然草地，人工草地放線菌門、已科河菌門、疣微菌門、Patescibacteria相對豐度顯著降低，變形菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)；撂荒草地放線菌門、綠彎菌門、Patescibacteria豐度顯著降低，酸桿菌門、變形菌門、芽單胞菌門、已科河菌門、消化螺菌門豐度顯著升高(P<0.05)。

細(xì)菌屬水平上，Subgroup_6,RB41,67-14,KD4-96,紅色桿菌屬(Rubrobacter)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、蓋勒氏菌屬(Gaiella)、MB-A2-108,Subgroup_7等10個屬占總相對豐度的近41%(圖4)。對比天然草地，人工草地RB41,67-14,土壤紅桿菌屬、蓋勒氏菌屬、MB-A2-108相對豐度顯著降低，鞘氨醇單胞菌屬相對豐度顯著升高(P<0.05)。撂荒草地Subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬、Subgroup_7相對豐度顯著升高，67-14,KD4-96、土壤紅桿菌屬、蓋勒氏菌屬、MB-A2-108相對豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 細(xì)菌屬水平下的群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 4 Community structure composition of bacteria at genus level注：1.Subgroup_6；2.RB41；3.67-14；4.KD4-96；5.紅色桿菌屬；6.土壤紅桿菌屬；7.鞘氨醇單胞菌屬；8.蓋勒氏菌屬；9.MB-A2-108；10.Subgroup_7Note:1. Subgroup_6;2. RB41;3. 67-14;4. KD4-96;5. Rubrobacter;6. Solirubrobacter;7. Sphingomonas;8. Gaiella;9. MB-A2-108;10. Subgroup_7

2.4 土壤因子與細(xì)菌群落的關(guān)系

為揭示土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系，以門和屬水平上的土壤細(xì)菌群落相對豐度作為響應(yīng)變量，土壤理化因子作為環(huán)境解釋變量進(jìn)行了冗余分析(RDA)。如圖5所示，門水平上軸1和軸2的解釋變量分別為65.99%和32.39%(圖5-a)，土壤因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響明顯；放線菌門、綠彎菌門和疣微菌門相對豐度與土壤有機質(zhì)和土壤速效氮含量呈正相關(guān)關(guān)系；變形菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門相對豐度與土壤有機質(zhì)、土壤全氮、土壤速效氮、土壤全鉀和土壤速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與土壤容重呈正相關(guān)關(guān)系；酸桿菌門、已科河菌門和消化螺菌門相對豐度與土壤含水量、pH、土壤全氮、土壤全鉀和速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系。屬水平上軸1和軸2的解釋變量分別達(dá)到63.23%和29.96%(圖5-b)，Subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬和Subgroup_7相對豐度與土壤含水量和土壤pH呈正相關(guān)關(guān)系；RB41、紅色桿菌屬相對豐度與土壤全氮、土壤全鉀和土壤速效鉀含量呈正相關(guān)關(guān)系；67-14,KD4-96、土壤紅桿菌屬和MB-A2-108相對豐度與土壤有機質(zhì)和速效氮含量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖5 土壤細(xì)菌群落與土壤因子的冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis(RDA) of soil bacterial community and soil factors注：a，土壤細(xì)菌門水平；b，土壤細(xì)菌屬水平Note:a,Soil bacteria level of phylum;b,Soil bacteria level of genus

3 討論

3.1 一年生人工草地持續(xù)利用與撂荒對土壤理化性質(zhì)的影響

隨著建立年限的增加，人工草地土壤環(huán)境得到明顯的改善[21-22]。張莉等[23]對人工草地建植后土壤的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，認(rèn)為土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷含量得到提升，土壤pH值降低。本研究中人工草地的持續(xù)利用對土壤有機質(zhì)含量的影響不明顯，土壤全氮、土壤速效氮和速效鉀含量顯著降低，原因可能是人工草地種植植被和利用方式不同。郝良杰等[24]在人工種植牧草對退化沙質(zhì)草甸土養(yǎng)分性狀的影響研究中發(fā)現(xiàn)，種植燕麥與苜蓿(MedicagosativaL.)對于提升土壤有機質(zhì)含量存在著顯著性的差異。魏學(xué)紅等[21]對人工草地建植改良青藏高原東緣“黑土型”退化草甸的土壤養(yǎng)分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)由于地上植被的快速生長利用和消耗，隨著人工草地建植年限的增長土壤速效養(yǎng)分含量顯著降低，這與本文研究結(jié)果相一致。說明一年生燕麥人工草地在長期的利用過程中，植被的快速生長和產(chǎn)量輸出消耗了土壤養(yǎng)分，這可能是本研究中土壤全氮、土壤速效氮和速效鉀含量顯著降低的主要原因。賈倩民等[25]研究不同人工草地對干旱區(qū)撂荒地土壤理化性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)不同牧草建植的人工草地土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮和速效磷含量均顯著高于撂荒地。本研究發(fā)現(xiàn)，與天然草地相比撂荒草地土壤pH顯著升高，土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮和速效鉀含量顯著降低，表明一年生人工草地撂荒導(dǎo)致土壤養(yǎng)分含量降低。

3.2 一年生人工草地持續(xù)利用與撂荒對土壤細(xì)菌群落的影響

土壤微生物細(xì)菌OTU數(shù)量是反映土壤微生物最基本特征的一個重要指標(biāo)，分類單元OTU數(shù)量通常代表不同微生物物種，OTU數(shù)量越多代表著微生物種類越多[26]。本研究中，人工草地和撂荒草地土壤細(xì)菌OTU數(shù)量升高，其中人工草地升高幅度最大。Sun等[27]研究了不同翻耕深度和季節(jié)對土壤微生物的影響，認(rèn)為土壤表層5 cm的長期耕作措施增加了土壤微生物的數(shù)量；郭婷[28]研究了草甸黑土的耕作和施肥對細(xì)菌多樣性的影響，認(rèn)為深耕處理使土壤中微生物的含量提高，與本研究結(jié)果相一致。其原因可能是土壤的翻耕方式使土壤表面的植物的殘枝落葉或施加的肥料更好的轉(zhuǎn)移到土壤深層，翻耕使土壤變得更加疏松，增加了土壤的孔隙度，透氣性增高，有利于微生物生存和生長。因此，土壤微生物數(shù)量得到明顯的提升。PCA分析表明，人工草地近21 a的持續(xù)利用改變了土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成，這可能是人工草地細(xì)菌群落多樣性顯著升高的主要原因。撂荒草地與人工草地不同，翻耕與施肥等人工干預(yù)較少(僅有1次)，因此土壤細(xì)菌多樣性與天然草地?zé)o顯著差異。

研究發(fā)現(xiàn)放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)是3個樣地土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成中的優(yōu)勢菌門，這與大多數(shù)草地土壤細(xì)菌多樣性研究結(jié)果相一致[29-31]。已有的研究結(jié)果認(rèn)為，放線菌門與適應(yīng)環(huán)境及抵御外界干擾有關(guān)；變形菌門是世界上最為普遍的菌門之一，其與土壤碳的利用有關(guān)；酸桿菌門與土壤的貧瘠程度有關(guān)[32-33]。本研究中，與天然草地相比，人工草地和撂荒草地放線菌門豐度顯著降低，表明2種草地的利用方式使草地對抗外界干擾的能力在下降；變形菌門豐度顯著升高，可能是土壤擾動使土壤中的碳在被持續(xù)消耗，具體原因還有待進(jìn)一步研究；撂荒草地酸桿菌門豐度升高和綠彎菌門豐度降低(P<0.05)，這是土壤貧瘠的表現(xiàn)。對比天然草地，撂荒草地土壤細(xì)菌Subgroup_6和Subgroup_7相對豐度顯著升高，RB41屬相對豐度較高，3者均屬于酸桿菌門[34]，可能是撂荒草地酸桿菌門豐度顯著升高的主要原因。

3.3 土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

大量研究表明，土地的利用方式是影響土壤質(zhì)量的主要因素，通過植物特征、管理方式等影響土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成[35-36]。土壤pH被認(rèn)為是影響土壤細(xì)菌分布和群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤含水量、pH、土壤容重、有機質(zhì)含量、全氮含量、速效氮含量、全鉀含量和速效鉀含量是細(xì)菌門、屬水平的群落結(jié)構(gòu)組成的主要作用因子。酸桿菌門相對豐度與pH呈正相關(guān)關(guān)系，與鄧楚璇等[39]在土地利用方式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究結(jié)果一致。本研究中放線菌門、變形菌門相對豐度與pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這是因為高寒地區(qū)土壤整體營養(yǎng)狀況較差，土壤pH偏堿性[37]。土壤容重可以影響土壤的透氣性、持水能力，進(jìn)而影響到微生物的活動[40]。變形菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門與土壤容重呈正相關(guān)關(guān)系，表明3個菌門具有較強的生態(tài)適應(yīng)能力。蓋勒氏菌屬、MB-A2-108、67-14、土壤紅桿菌屬相對豐度與土壤有機質(zhì)、土壤全氮、土壤速效氮、土壤全鉀和土壤速效鉀含量呈正相關(guān)關(guān)系，反映出4個菌屬對土壤養(yǎng)分的偏好。細(xì)菌群落屬水平上還有大量的未知或不可培養(yǎng)類群，占主要菌屬(排序前10屬)總豐度值的近62.95%，其作用功能等還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

高寒草甸類草原建植一年生燕麥人工草地與天然草地相比，土壤全氮、土壤速效氮和速效鉀含量顯著降低；撂荒導(dǎo)致土壤pH顯著升高，土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮和速效鉀含量顯著降低。近21 a的人工草地持續(xù)利用不僅改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成方式，也明顯提升了細(xì)菌群落的多樣性；撂荒沒有改變土壤細(xì)菌群落多樣性，但改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。因此，高寒草甸建植一年生人工草地在持續(xù)利用的過程中應(yīng)注意土壤速效養(yǎng)分的補給，以免影響草地的生產(chǎn)力。對撂荒草地應(yīng)及時采取恢復(fù)技術(shù)措施，避免撂荒草地發(fā)生退化。