DNA損傷標志物γ-H2AX及其在毒性測試應(yīng)用中的研究進展

瞿敏敏，陳 佳，郭 磊，徐 華，謝劍煒

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

DNA是最重要的生命遺傳物質(zhì)之一，保持DNA的完整性和穩(wěn)定性對于生物體的正常生長發(fā)育和機體功能正常運轉(zhuǎn)至關(guān)重要。然而，DNA會受到外源性和內(nèi)源性諸多因素的影響和干擾［1］，進而造成不同程度損傷，如食品污染物、環(huán)境污染物、藥品雜質(zhì)、紫外線、電離輻射乃至正常代謝產(chǎn)生的活性氧等，均會對DNA造成損傷［2-3］。其中，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是一種最嚴重的DNA損傷形式，如未能及時修復(fù)，將可能導(dǎo)致疾病甚至誘發(fā)癌癥［4］。因此，DNA損傷的檢測對于基因組穩(wěn)定性的監(jiān)測以及及早發(fā)現(xiàn)并預(yù)防重大疾病具有重要意義。1998年，Rogakou等［5］首次報道，磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）是一種表征DNA損傷尤其是DSB的特異性生物標志物，且其形成的焦點數(shù)與DSB數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系。因此，旨在檢測γ-H2AX的試驗（簡稱γ-H2AX試驗）被應(yīng)用于眾多與DNA損傷相關(guān)的基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)診斷中。目前，γ-H2AX試驗已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)、輻射生物劑量學(xué)、藥物研發(fā)和療效評估等研究領(lǐng)域，尤其在對化合物基因毒性的體外初步篩選方面，顯示出極大的應(yīng)用潛力［6］。本文系統(tǒng)綜述近年來γ-H2AX試驗在基因毒性測試中的研究進展，并展望其在基因毒性風(fēng)險評估中的應(yīng)用前景。

1 γ-H2AX的生成及生物學(xué)意義

1.1 H2AX和 γ-H2AX

組蛋白是真核細胞特有的一類堿性蛋白質(zhì)，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成和基因功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。通常由核心組蛋白H2A，H2B，H3和H4各2個分子組成1個組蛋白八聚體，其被147 bp的DNA包裹形成染色質(zhì)的基本組成單位——核小體，而H1作為連接組蛋白，起到穩(wěn)定核小體間DNA的作用［7］。H2A蛋白家族具有多樣的變體，包括H2A1、H2A2、H2AX、H2AZ和其他變體［8-9］。在人類細胞中，H2AX占H2A含量的2%～10%［5］，分子質(zhì)量為14 ku，其編碼基因位于11號染色體的q23.2～q23.3，共編碼142個氨基酸。H2AX多肽鏈N端的120個殘基與H2A1的該段氨基酸序列幾乎完全一致，而C端的22個殘基序列與目前已知的脊椎動物H2A家族其他蛋白序列無同源性。C端序列在進化上高度保守，包括1個含139位絲氨酸（Ser-139）的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu，SQE）結(jié)構(gòu)域（圖1）。SQE結(jié)構(gòu)域在不同種屬生物體中高度保守［10-11］，該進化保守性提示H2AX的C端序列可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖1 組蛋白H2AX多肽鏈C端高度保守的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸結(jié)構(gòu)域.Y：酪氨酸；E：谷氨酸；Q：谷氨酰胺；S：絲氨酸；A：丙氨酸.

1998年，Bonner團隊首次發(fā)現(xiàn)并報道，電離輻射誘導(dǎo)DSB數(shù)分鐘后，細胞內(nèi)H2AX蛋白的Ser-139位點可被毛細血管共濟失調(diào)突變基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、ATM與Rad3相關(guān)蛋白（ATM and Rad3-related protein，ATR）及DNA依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）快速磷酸化，生成γ-H2AX［5］。γ-H2AX聚集在DSB處，形成γ-H2AX焦點。研究表明，γ-H2AX焦點在DSB發(fā)生數(shù)分鐘內(nèi)即可形成，且在30 min內(nèi)達到峰值；隨后γ-H2AX會隨著DSB的修復(fù)而逐漸去磷酸化或被正常的H2AX取代，其半衰期約為2～7 h［12］。在哺乳動物細胞中，每產(chǎn)生1個DSB可導(dǎo)致γ-H2AX擴散到2 Mb染色質(zhì)上，包括近2000個γ-H2AX分子［11］。

1.2 γ-H2AX的生物學(xué)意義

外源性因素如輻射［13］、熱效應(yīng)［14］、滲透壓改變［15］和化學(xué)暴露物［16］，內(nèi)源性因素如細胞凋亡［17］、衰老［18］和有絲分裂［19］，均可導(dǎo)致細胞內(nèi)γ-H2AX形成。一旦內(nèi)外源性因素誘導(dǎo)DSB形成，細胞即刻激活DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）機制，于DSB處募集大量信號分子和修復(fù)蛋白，對損傷的DNA進行修復(fù)，以維持基因組的完整性和細胞的正常功能［20］。其中，γ-H2AX焦點的形成是DSB發(fā)生后早期被招募的蛋白復(fù)合體之一，并為其他修復(fù)蛋白提供結(jié)合位點。ATM，ATR和DNA-PKcs均可催化H2AX的磷酸化，ATR被認為是單鏈損傷及復(fù)制損傷誘導(dǎo)形成γ-H2AX的主要磷酸化激酶［21］，DNAPKcs則介導(dǎo)細胞凋亡過程中H2AX的磷酸化［22］。

DSB誘導(dǎo)H2AX的磷酸化主要通過ATM激酶介導(dǎo)。細胞感應(yīng)DNA損傷后，ATM發(fā)生自動磷酸化而激活，三聚復(fù)合物Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）首先識別DNA損傷，隨后募集活化的ATM到損傷位點，使ATM靶向下游底物，如H2AX蛋白、p53結(jié)合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）和DNA損傷檢控點介體1（mediator of DNA damage check?point 1，MDC1），磷酸化細胞周期檢測點激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）和CHK2，激活周期檢查點，H2AX蛋白的Ser-139磷酸化作為DNA損傷起始信號，招募細胞周期相關(guān)蛋白和修復(fù)蛋白至損傷位點，與γ-H2AX結(jié)合形成焦點（圖2）。MDC1蛋白通過與γ-H2AX結(jié)合，錨定ATM以募集更多活化的ATM，進一步放大H2AX磷酸化信號。Nijmegen斷裂綜合征蛋白1（Nijmegen breakage syndrome protein 1，NBS1）與γ-H2AX結(jié)合促使越來越多的DDR蛋白包括53BP1和MRN復(fù)合物聚集在DNA損傷位點，即γ-H2AX作為錨點募集DDR中介物以及更多修復(fù)蛋白到損傷位點，釋放生物信號并引導(dǎo)修復(fù)蛋白對DNA進行修復(fù)［23-25］。因此，γ-H2AX被認為是可同時表征DNA損傷和修復(fù)的生物標志物。

圖2 磷酸化組蛋白H2AX形成過程［22］及主要檢測技術(shù).WB：Western印跡法；IF：免疫熒光顯微技術(shù)；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗；FCM：流式細胞術(shù)；HCA：高內(nèi)涵分析技術(shù)；LC-MS/MS：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；S：組蛋白H2AX的139位絲氨酸；P：組蛋白H2AX的139位絲氨酸發(fā)生磷酸化；DSB：DNA雙鏈斷裂；MRN：三聚復(fù)合物Mre11-Rad50-Nbs1；ATM：毛細血管共濟失調(diào)突變基因；53BP1：P53結(jié)合蛋白1；BRCA1：乳腺癌1號基因蛋白；MDC1：DNA損傷檢控點介體1.

2 γ-H2AX試驗在體外基因毒性評價中的應(yīng)用

基因毒性物質(zhì)是指能直接或間接損傷細胞DNA而導(dǎo)致基因突變或體內(nèi)誘變的物質(zhì)，具有誘發(fā)癌癥的潛在威脅［26-27］。因此，建立基因毒性物質(zhì)的通量篩查測試方法是安全性評估的重要組成部分。傳統(tǒng)的基因毒性評價方法依賴動物實驗，費用高，周期長，種屬差異大［28］。隨著21世紀“3R”原則與毒性測試替代策略的提出，細菌回復(fù)突變（Ames）試驗、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗、小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變試驗和體外微核（micronucleus，MN）試驗已被較好的發(fā)展并應(yīng)用，但一定程度上均存在特異性低的缺陷［29］。

近年來，為實現(xiàn)基因毒性物質(zhì)的快速通量篩查，研究者提出了從基因損傷共性效應(yīng)靶分子入手。如DNA損傷和修復(fù)的生物標志物γ-H2AX，作為一種早期敏感的基因毒性生物標志物，可由多種類型的DNA損傷（DSB、DNA加合物、DNA單鏈斷裂、DNA氧化和烷基化）誘導(dǎo)產(chǎn)生。也有研究者提出，可將γ-H2AX作為篩選基因毒性的生物標志物并應(yīng)用于監(jiān)管評估中［6］。在此推動下，目前國內(nèi)外已發(fā)展多種技術(shù)（圖2），通過檢測γ-H2AX對累計200余種化學(xué)物質(zhì)的基因毒性開展了測試（表1）。

表1 不同檢測技術(shù)在 γ-H2AX體外基因毒性研究中的應(yīng)用

2.1 雙向凝膠電泳技術(shù)

雙向凝膠電泳是分離和定量組蛋白混合物的基本方法之一。最初，Rogakou等［5］應(yīng)用二維凝膠電泳技術(shù)檢測暴露于電離輻射后CHO細胞、SF268細胞和DBA/2小鼠形成的γ-H2AX焦點。結(jié)果表明，γ-H2AX在DNA損傷后約10 min即可被該技術(shù)檢測。該技術(shù)雖是發(fā)現(xiàn)γ-H2AX的主要技術(shù)，但所需樣本量較大，過程繁瑣耗時，且無法實現(xiàn)高通量檢測。

2.2 免疫化學(xué)檢測技術(shù)

免疫化學(xué)檢測技術(shù)是基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和靈敏性、以熒光素及酶等對抗原或抗體加以標記，經(jīng)過化學(xué)呈色反應(yīng)后，用顯微鏡或電子顯微鏡觀察，對靶蛋白進行檢測的技術(shù)。由于其靈敏度高、特異性強且應(yīng)用范圍廣，可對靶蛋白進行定位、定性和定量。因此，目前γ-H2AX試驗主要是基于該技術(shù)。

2.2.1 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

Western印跡法是在凝膠電泳技術(shù)和固相免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫化學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)通過特異性抗γ-H2AX抗體對經(jīng)凝膠電泳等步驟處理過的生物樣品著色，分析著色的位置和深度，對目標蛋白γ-H2AX進行定性和半定量分析。Western印跡法結(jié)果準確，穩(wěn)定可靠，但其操作過程繁瑣，不利于大規(guī)模的篩選分析。隨著現(xiàn)代儀器的發(fā)展，Khoury 等［30］于 2013 年建立了一種基于Western印跡法改進的γ-H2AX試驗，命名為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（in cell Western，ICW），并首次用歐洲替代方法驗證中心（European Center for Validation of Alternative Methods，ECVAM）推薦的包括基因毒性和非基因毒性在內(nèi)的61個化合物在HepG2細胞中對該技術(shù)進行了驗證。結(jié)果顯示，ICW技術(shù)檢測γ-H2AX焦點水平的特異性達90%，靈敏度為75%。之后，為了驗證ICW技術(shù)，該課題組在多種細胞中評估了不同化合物的基因毒性［31-35］，結(jié)果表明，基于ICW技術(shù)的γ-H2AX實驗可準確評估化合物的基因毒性。

2.2.2 免疫熒光顯微技術(shù)

免疫熒光顯微技術(shù)是首先利用特異性抗體對目標γ-H2AX進行識別，隨后利用標記熒光基團或加入偶聯(lián)有熒光基團的二抗進行信號放大，通過熒光顯微鏡分析熒光信號，對細胞內(nèi)形成的γ-H2AX焦點進行計數(shù)，以確定γ-H2AX分布和含量。2006年，Zhou等［36］利用免疫熒光顯微技術(shù)首次分析了2個具直接作用的基因毒性化合物甲磺酸甲酯與N-亞硝基-N-乙基脲及2個具間接作用的基因毒性化合物苯并芘與2-乙酰氨基芴作用于人羊膜FL細胞和中國倉鼠CHL細胞后的γ-H2AX焦點水平變化，認為γ-H2AX焦點是評判基因毒性的理想指標，其結(jié)果與彗星試驗結(jié)果呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

2.2.3 全細胞酶聯(lián)免疫吸附試驗（cell enzymelinked immunosorbent assay，Cell-ELISA）

Cell-ELISA檢測γ-H2AX焦點的方法通常是利用抗γ-H2AX的單抗與經(jīng)甲醇固定后的細胞培養(yǎng)物共孵育，再經(jīng)酶標二抗識別，隨后酶催化特異性底物產(chǎn)生一定量的顯色產(chǎn)物，通過分析顏色信號實現(xiàn)γ-H2AX的定性或半定量。該技術(shù)的主要優(yōu)點是操作方便簡單、快速和高通量［37-38］。Matsuzaki等［37］分別應(yīng)用Cell-ELISA和免疫熒光顯微技術(shù)，在CHL，CHO和V79細胞中評價了6個非整倍體誘導(dǎo)劑、8個染色體斷裂劑和10個非基因毒性化合物。結(jié)果表明，非整倍體誘導(dǎo)劑和非遺傳毒性化合物的試驗結(jié)果均呈陰性，而染色體斷裂劑中除5-氟尿嘧啶在CHO細胞中的試驗結(jié)果為陰性外，其余均為陽性。

2.2.4 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)是將經(jīng)過免疫熒光標記的細胞使用流式細胞儀進行分選檢測，得出單個細胞核中γ-H2AX的熒光強度與標記細胞總熒光強度的百分比，進而得到定量結(jié)果。該技術(shù)不僅可快速定量多細胞群中的γ-H2AX，而且可同時定量分析細胞毒性和細胞周期分布［39-52］。Smart等［41］通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)γ-H2AX以評估作用機制不同的基因毒性化合物和非基因毒性化合物。結(jié)果表明，其對Ames試驗的特異性達到67%，預(yù)測靈敏度高達100%；對體外哺乳動物基因毒性試驗的特異性和靈敏度分別為89%和91%。Tsamou等［44］將HepG2細胞暴露于ECVAM推薦的基因毒性化合物和非基因毒性化合物，通過流式細胞儀進行γ-H2AX檢測，發(fā)現(xiàn)其特異性為78%，靈敏度為54%，將γ-H2AX試驗與其他試驗如染色體畸變試驗或小鼠淋巴瘤細胞突變試驗等組合后則可顯著提高測試的準確度。

2.2.5 高內(nèi)涵分析（high content analysis，HCA）技術(shù)

HCA是一種新發(fā)展的自動化熒光顯微成像技術(shù)，其作為一種化合物毒性通量檢測的新方法，能在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)上，利用多種熒光標記物標記細胞，自動化地檢測樣品對細胞的生理狀態(tài)和屬性等影響。該技術(shù)具有快速、準確及通量檢測的優(yōu)點，且可自動化處理分析大批量的實驗數(shù)據(jù)［53-55］。Garcia-Canton等［53］在人支氣管上皮細胞系BEAS-2B中采用HCA技術(shù)評價了ECVAM推薦的包括基因毒性和非基因毒性化合物在內(nèi)的22個化合物，發(fā)現(xiàn)基于γ-H2AX的體外基因毒性試驗的特異性、靈敏度和準確度分別達88%，92%和86%。Ando等［54］用19個基因毒性化合物和7個非基因毒性化合物作用于HepG2細胞，利用HCA技術(shù)檢測γ-H2AX的形成。結(jié)果顯示，基于HCA的體外γ-H2AX試驗的靈敏度達到100%。最近的一項研究報道，采用代謝能力強的HepaRG細胞進行γ-H2AX的HCA，證明黃曲霉毒素B1、苯并芘、7，12-二甲基苯并蒽、氟蟲腈和硫丹的基因毒性，并驗證了γ-H2AX試驗應(yīng)用于基因毒性篩查的適用性［31］。

2.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high liquid chroma?tography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)

近20年來，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，逐漸利用LC-MS/MS技術(shù)解析組蛋白的變化［56-57］。Matsuda等［57］采用LC-MS/MS技術(shù)，對γ-H2AX磷酸化位點即包含Ser-139的特定肽段ATQAp?SQEY進行定量檢測，并同時對H2AX肽段ATQA?SQEY進行檢測，創(chuàng)建了一種可絕對定量分析細胞內(nèi)γ-H2AX的LC-MS/MS方法。

本課題組近期亦建立了γ-H2AX質(zhì)譜定量檢測技術(shù)，在HepG2細胞中評估了ECVAM推薦的包括基因毒性化合物和非基因毒性化合物在內(nèi)的69個化合物。結(jié)果表明，基于質(zhì)譜技術(shù)的γ-H2AX試驗特異性、靈敏度和準確度分別達到100%，88%和96%。基于質(zhì)譜定量監(jiān)測進一步獲得DNA損傷及修復(fù)動力學(xué)曲線，初步揭示修復(fù)速率與基因毒性化合物的致癌性水平密切相關(guān)，致癌性強的化合物通常呈現(xiàn)需較長的修復(fù)時間；通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型計算關(guān)鍵動力學(xué)參數(shù)，可應(yīng)用于基因毒性化合物的測試及其致癌性的預(yù)測評估［56］。目前對該方法的應(yīng)用加以拓展，證實可初步應(yīng)用于藥品中基因毒性雜質(zhì)的篩查鑒定，將藥品簡單用水溶解后直接暴露細胞，藥物成分和賦形劑均不干擾測定，具有簡便、靈敏度高及準確度好的特點，可實現(xiàn)藥品中基因毒性雜質(zhì)的快速通量篩查［58］。

3 γ-H2AX試驗與其他基因毒性試驗的性能對比

Westerink等［59］基于體外MN試驗在HepG2細胞中評估了ECVAM推薦的化合物，并比較了MN試驗和γ-H2AX試驗的敏感性和特異性。結(jié)果顯示，γ-H2AX試驗在檢測基因毒性化合物方面更具優(yōu)勢，如可避免假陰性結(jié)果等。Khoury等［30］也表明，通過MN試驗，N-亞硝基-N-乙基脲、2-乙酰氨基芴、氯化鎘、對苯二酚和齊多夫定均未被檢測出基因毒性特點，但在γ-H2AX實驗中這些化學(xué)物質(zhì)均呈現(xiàn)正確的陽性結(jié)果。

最近，Kim等［60］使用彗星試驗和γ-H2AX試驗在HepG2細胞系中檢測了甲磺酸乙酯、N-亞硝基-N-乙基脲、紫外線照射與苯并［a］芘-7，8-二醇-9，10-環(huán)氧化合物的DNA損傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)低濃度的甲磺酸乙酯和N-亞硝基-N-乙基脲誘導(dǎo)γ-H2AX焦點生成呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，其靈敏度比彗星試驗高10倍。同樣，Nikolova等［16］報道，相比于彗星試驗，γ-H2AX試驗?zāi)芨煽俊⒏`敏及更準確地評價基因毒性化合物。Dertinger等［52］亦報道，γ-H2AX試驗和MN試驗檢測致染色體斷裂化合物的結(jié)果呈現(xiàn)一致性。

4 體外 γ-H2AX試驗注意事項

盡管γ-H2AX試驗展現(xiàn)出良好的體外基因毒性評價前景，但在實際應(yīng)用過程中仍存在一些值得關(guān)注的問題。

4.1 細胞模型的選擇

在γ-H2AX試驗中，細胞模型對結(jié)果的敏感性影響很大。通常，人源細胞比目前體外毒理試驗中廣泛使用的嚙齒類動物細胞更接近人體對藥物的代謝規(guī)律，因此更適合于γ-H2AX試驗。如HepG2細胞，自身存在多種藥物代謝酶，使用該細胞進行試驗時無需再加入體外代謝活化系統(tǒng)，可簡化試驗步驟并降低試驗成本［32］。本課題組近期研究亦發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞對于基因毒性化合物及基因毒性雜質(zhì)的毒性測試是一種理想的細胞模型［56，58］。但有研究者認為，腫瘤細胞DNA的損傷修復(fù)機制和細胞周期調(diào)控功能均發(fā)生了異常變化，而γ-H2AX參與細胞DNA損傷應(yīng)答和細胞周期調(diào)節(jié)，因此正常細胞比腫瘤細胞更可靠［36］。

4.2 避免細胞凋亡導(dǎo)致的 γ-H2AX假陽性

細胞凋亡等內(nèi)源性因素也可誘導(dǎo)γ-H2AX的形成，細胞毒性是γ-H2AX試驗的干擾因素之一［61］。Tsamou等［44］發(fā)現(xiàn)，非整倍體化合物在細胞毒性較高時誘導(dǎo)細胞凋亡，從而產(chǎn)生凋亡型的γ-H2AX焦點，而致染色體斷裂劑則誘導(dǎo)細胞形成DNA損傷型的γ-H2AX焦點。因此，建議試驗時需要預(yù)先對化合物進行細胞增殖試驗評價，從而選擇不超過50%抑制濃度的化合物濃度，降低凋亡型γ-H2AX焦點的形成［30，62］，以避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，越來越多的研究表明，H2AX磷酸化是指征DNA早期損傷的重要指標，在DNA損傷早期時間點檢測γ-H2AX，可更好地避免由細胞凋亡導(dǎo)致的γ-H2AX假陽性結(jié)果［52］。

5 體內(nèi) γ-H2AX試驗的應(yīng)用研究

大量研究表明，γ-H2AX在不同細胞系中均有表達［63］，但γ-H2AX用于基因毒性評估的體內(nèi)試驗研究尚未廣泛開展。Guerard等［64］評估了致癌物4-氯-鄰甲苯胺在不同雄性大鼠組織中的基因毒性。大鼠肝組織γ-H2AX免疫組化結(jié)果顯示，組織中可觀察到γ-H2AX陽性的細胞核。Matsuda等［65］以LC-MS/MS技術(shù)定量分析小鼠體內(nèi)γ-H2AX，發(fā)現(xiàn)睪丸中γ-H2AX水平最高（占總H2AX的2.3%），其次為骨髓（0.51%）、胃（0.28%）、腎（0.20%）、脾（0.20%）、肝（0.15%）和肺（0.10%）。他們進一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠分別ip給予致癌物絲裂霉素C和甲磺酸乙酯后，不同臟器中的γ-H2AX水平波動存在差異，其中骨髓、胃、腎、脾、肝和肺中γ-H2AX水平隨時間發(fā)生動態(tài)變化，而睪丸中γ-H2AX水平未改變，揭示通過監(jiān)測致癌物誘導(dǎo)的體內(nèi)γ-H2AX水平變化，可檢測致癌物在不同器官中的基因毒性。但目前關(guān)于γ-H2AX的體內(nèi)試驗研究仍較少，若將其作為現(xiàn)有體內(nèi)標準試驗的補充，則需采用更多種具不同基因毒作用模式的化學(xué)品進行研究，以明確其作為體內(nèi)標志物評價基因毒性的可行性。

6 γ-H2AX與其他毒性終點標志物的互補

隨著對化合物基因毒性理解的深入，研究者對基因毒性測試方法提出了更高的要求。如由于具不同基因毒性作用模式的化合物的致癌性存在顯著差異［66］，因此在候選藥物的前期篩選過程中將會被賦予不同的去留命運，具染色體毒性的化合物會被直接淘汰，而僅具紡錘體毒性的化合物則可被留下參與后續(xù)的非臨床研究。近期Motoyama等［67］撰文評述，應(yīng)開發(fā)能提供基因毒性作用機制信息的評價方法，區(qū)分判斷2種主要的基因毒性，即染色體毒性〔導(dǎo)致點突變和（或）結(jié)構(gòu)性染色體突變的DNA損傷〕或紡錘體毒性（染色體數(shù)量增加或減少）。目前研究表明，將γ-H2AX和其他效應(yīng)標志物相結(jié)合，將提供一種可行的區(qū)分不同基因毒性作用模式的化合物方法。

6.1 γ-H2AX與p-H3組合

在有絲分裂過程中，組蛋白H3的10位絲氨酸（Ser-10）經(jīng)Aurora激酶作用而發(fā)生磷酸化，以促使染色質(zhì)凝集和染色體分離。眾多研究已證實，組蛋白H3的Ser-10磷酸化（p-H3）是細胞有絲分裂的生物標志物。非整倍體誘導(dǎo)劑導(dǎo)致細胞有絲分裂延遲，使組蛋白H3的Ser-10發(fā)生顯著磷酸化，p-H3可作為指征非整倍體誘導(dǎo)劑的生物標志物［66］。Khoury等［33］在HepG2，LS174T和ACHN 3種細胞中評價了10種非整倍體誘導(dǎo)劑、5種染色體斷裂劑和5種細胞毒性化合物，采用ICW技術(shù)，基于γ-H2AX和p-H3生物標志物的組合，有效區(qū)分作用模式不同的基因毒性化合物。

本課題組前期通過LC-MS/MS技術(shù)對γ-H2AX的磷酸化位點即Ser-139的靶肽段及p-H3的磷酸化位點即Ser-10的靶肽段進行定量檢測，實現(xiàn)對γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3的同時定量監(jiān)測。進一步以HepG2和HeLa細胞為模型，評價了7個染色體斷裂劑、7個非整倍體誘導(dǎo)劑、2個細胞毒性化合物和3個非基因毒性化合物。結(jié)果表明，基于質(zhì)譜技術(shù)的γ-H2AX和p-H3測定方法，不僅能靈敏區(qū)分并準確定量具不同基因毒作用模式的化合物，還能動態(tài)監(jiān)測基因毒性化合物對DNA的損傷、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程［56］。

6.2 γ-H2AX與其他生物標志物組合

為進一步區(qū)分致染色體斷裂化合物的作用模式，Kopp等［68］以9種作用機制不同的致染色體斷裂化合物處理HepG2細胞，同時分析γ-H2AX、p-H3和其他6種參與DNA損傷信號通路的生物標志物。多參數(shù)分析表明，所選的8個生物標志物無法精確分類致染色體斷裂化合物作用模式，但γ-H2AX和磷酸化P53蛋白存在相關(guān)性，結(jié)合磷酸化P53蛋白的定量可提高基因毒性的篩查效率。

最近，Wilde等［69］提出，基于蛋白質(zhì)翻譯后修飾可對不同藥物的作用模式加以區(qū)分。該研究以96孔微孔板培養(yǎng)TK6細胞，采用不同藥物處理細胞后，應(yīng)用自動化細胞成像技術(shù)進行分析。結(jié)果顯示，基因毒性藥物和非基因毒性藥物在TK6細胞中誘導(dǎo)不同的生物標志物反應(yīng)，其中磷酸化的53BP1蛋白與誘導(dǎo)DSB的藥物呈現(xiàn)相關(guān)性，乙?；腜53蛋白則能區(qū)分被評價藥物的基因毒性和非基因毒性。

因此，γ-H2AX與其他生物標志物的組合策略可在檢測基因毒性的同時實現(xiàn)對不同基因毒性作用模式的評價區(qū)分。

7 結(jié)語

γ-H2AX作為同時表征DNA損傷修復(fù)的生物標志物，可作為指示基因毒性的特異性效應(yīng)指標。已經(jīng)建立了多種體外分析檢測細胞和組織內(nèi)的γ-H2AX的技術(shù)用于化合物體外基因毒性評價，其中免疫化學(xué)檢測技術(shù)較為常用，相比免疫化學(xué)技術(shù)，質(zhì)譜是新興發(fā)展的一種可絕對定量檢測γ-H2AX的技術(shù)，但其在通用性上還需要進一步驗證。由于不同細胞模型和細胞凋亡等其它因素的干擾，γ-H2AX試驗在體外基因毒性評價中仍存在一些限制。另一方面，目前關(guān)于γ-H2AX體內(nèi)試驗研究剛起步，有待采用更多的代表性化學(xué)物質(zhì)進行動物試驗以深入探討?？傊?，γ-H2AX試驗作為一項新的可以準確檢測DNA損傷的試驗，可應(yīng)用于基因毒性的體外高通量篩選評價；同時，γ-H2AX與p-H3等其他生物標志物的組合檢測可進一步提供一種快速有效區(qū)分化合物基因毒性作用模式的方法。但目前γ-H2AX檢測方法多樣，尚無統(tǒng)一的標準操作步驟，制約了其標準化推廣，因此采用更多的化合物以進一步驗證γ-H2AX試驗的穩(wěn)定性、可靠性以及建立相應(yīng)的規(guī)范化標準具有重要價值。