脊髓Pellino1敲減對(duì)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性痛的影響

付寶軍，姜靜靜，黃玉瓊，林宗航，李 恒

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 清遠(yuǎn) 511518）

長(zhǎng)春新堿（vincristine）是一種最常用化療藥物，在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，該藥在治療腫瘤同時(shí)常常誘導(dǎo)產(chǎn)生化療誘導(dǎo)神經(jīng)病理性痛（chemo?therapy-induced neuropathic pain，CINP）［1］，這種不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度通常與化療藥物使用劑量有關(guān)。目前臨床治療CINP的藥物不僅療效不理想，而且藥物本身的不良反應(yīng)也限制了其臨床應(yīng)用［2-3］。因此，闡明CINP發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)于開(kāi)發(fā)安全有效治療藥物具有重大臨床意義。隨著對(duì)CINP機(jī)制研究的不斷深入，膠質(zhì)細(xì)胞尤其小膠質(zhì)細(xì)胞在CINP中的作用得到更廣泛關(guān)注［4-5］。研究表明，腹腔注射長(zhǎng)春新堿導(dǎo)致 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)激活，同時(shí)伴有小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞活化［6］。在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)CINP模型中，Notch信號(hào)促進(jìn)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子C-X3-C-基元受體 1〔chemokine（C-X3-C motif）receptor 1，CX3CR1〕/p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mito?gen-activated protein kinase，p38 MAPK）通路活化［7］，但在CINP中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。Pellino（Peli）是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)E3泛素連接酶家族，包括Peli1，Peli2和Peli3［8］。最近研究顯示，Peli1通過(guò)促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（tumer necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）的泛素化，激活心肌中MAPK和NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［9-11］。另一項(xiàng)研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞中，Peli1通過(guò)泛素化激活白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體相關(guān)激酶/TRAF6復(fù)合物介導(dǎo) Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)炎癥反應(yīng)［12］。Peli1作為一種小膠質(zhì)細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子，參與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［13］、蛛網(wǎng)膜下腔出血［14］和西尼羅病毒腦炎的病理生理過(guò)程［15］。有研究報(bào)道，坐骨神經(jīng)壓迫損傷模型中，大鼠脊髓Peli1通過(guò)增加K63相關(guān)TRAF6泛素化，從而激活MAPK信號(hào)通路［16］。更值得關(guān)注的是，最近研究表明，在坐骨神經(jīng)壓迫致神經(jīng)病理性痛和嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中，脊髓背角Peli1蛋白表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)活化小膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生和維持過(guò)程［16-17］。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角Peli1蛋白參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺(jué)過(guò)敏，其機(jī)制與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)［18］。然而Peli1在CINP中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)CINP大鼠模型，通過(guò)鞘內(nèi)注射表達(dá)Peli1短發(fā)夾RNA（Peli1 short hairpin RNA，shPeli1）的慢病毒靶向抑制Peli1，探討Peli1在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)CINP中的作用及其可能機(jī)制，為CINP發(fā)生機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)，為研發(fā)防治CINP新藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

注射用硫酸長(zhǎng)春新堿（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H20068151）。山羊抗大鼠Peli1、離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、磷酸化 p38 MAPK（phospho-p38 MAPK，p-p38 MAPK）、p38 MAPK、p-c-Jun N 端激酶（p-c-Jun N-terminal kinases，p-JNK）、JNK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）和 p-ERK1/2單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體、CY3標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體和cDNA第一鏈合成試劑盒（美國(guó)Invit?rogen公司）；RT-PCR試劑盒（美國(guó)Abcam公司）；干擾shRNA（scrambled shRNA，shscr）、shRNA寡核苷酸鏈和慢病毒質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。NK3酶標(biāo)儀（iMark，美國(guó)Bio Tek公司）；高速離心機(jī)（5415R，德國(guó)Eppendorf公司）；凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；熒光顯微鏡（DM4000B，德國(guó)Leica公司）；PE-10導(dǎo)管（上海瑾瑜科學(xué)儀器有限公司）；Von frey纖維絲刺激針（37400，意大利Ugo Basile公司）；熱輻射痛刺激儀（美國(guó)，Stoelting公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重200～230 g，10～12周齡，由廣東省醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2019-0206。12 h光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。室溫21.5～22.5℃，濕度45%～65%。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理要求并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則進(jìn)行。

1.3 慢病毒介導(dǎo)shRNA構(gòu)建

1.3.1 shRNA寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)合成

根據(jù)Peli1微RNA序列設(shè)計(jì)Peli1 shRNA（shPeli1）1，2和3及shscr（陰性對(duì)照），每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA，正、反義鏈的5′端分別引入GATCC和AATTC，分別與BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的黏性末端互補(bǔ)，經(jīng)Blast比對(duì)，與人類其他基因編碼序列無(wú)同源性。shPeli1和shscr寡核苷酸鏈由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 Peli1 shRNA慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建

用BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將shRNA寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA并與雙酶切后的質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆后委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。Peli1 shRNA1：5′-GGATTTATGCTG?CAGGGTTTG-3′；Peli1 shRNA2：5′-GGTGGTT?GAATATACTCATGA-3′；Peli1 shRNA3：5′GGTTCACAGAAGACTCCAAAC-3′；shscr：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 大鼠鞘內(nèi)置管術(shù)

大鼠ip給予戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉后，參照Yaksh等［19］方法進(jìn)行鞘內(nèi)置管。定位于大鼠L3～L4棘突間隙，常規(guī)備皮，消毒，俯臥位固定，切開(kāi)皮膚，鈍性分離棘突兩側(cè)肌肉與筋膜，暴露并挑破硬脊膜后將PE-10導(dǎo)管向頭端置入約2 cm，觀察大鼠是否出現(xiàn)甩尾反射及是否有腦脊液流出，若出現(xiàn)則說(shuō)明置管順利。固定導(dǎo)管，并將導(dǎo)管經(jīng)皮下隧道至頸部引出，消毒縫皮后單籠飼養(yǎng)。置管后通過(guò)PE-10導(dǎo)管注射2%利多卡因15 μL，如果30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹（肢體完全不能活動(dòng)且不見(jiàn)肌肉的收縮）且30 min后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)正常，則判定為置管成功。剔除肌力減退或癱瘓（即后爪不能完全伸展、行走時(shí)轉(zhuǎn)圈或傾倒及不能自發(fā)行走）的大鼠。

1.5 大鼠分組和藥物處理

1.5.1 正常大鼠脊髓Peli1敲減實(shí)驗(yàn)

正常雄性SD大鼠行鞘內(nèi)置管術(shù)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為shscr組和shPeli1組（n=9），分別于術(shù)后第2～4天（D2～D4）每天1次鞘內(nèi)注射shscr慢病毒10 μL或shPeli1慢病毒10 μL（2×108TU）。于術(shù)后D4，D6，D8，D10和D12進(jìn)行機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏行為學(xué)檢測(cè)（機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)結(jié)束30 min后行熱痛覺(jué)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)），D12行為學(xué)檢測(cè)后30 min處死大鼠，取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，分別用Western印跡法和RT-PCR檢測(cè)Peli1蛋白和mRNA表達(dá)水平（實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1A）。

1.5.2 CINP模型大鼠脊髓Peli1敲減實(shí)驗(yàn)

正常雄性SD大鼠行鞘內(nèi)置管術(shù)后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CINP組、CINP+shscr組和CINP+shPeli1組。CINP+shscr組和CINP+shPeli1組分別于鞘內(nèi)置管術(shù)后D2～D4每天1次鞘內(nèi)注射shscr慢病毒10 μL或shPeli1慢病毒10 μL（2×108TU）［16］。于鞘內(nèi)置管術(shù)后D5開(kāi)始，除正常對(duì)照組外，其余各組隔日ip給予長(zhǎng)春新堿125 mg·kg-1（共4次）［20］，分別于鞘內(nèi)置管術(shù)后D4，D6，D8，D10和D12進(jìn)行機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏（機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)結(jié)束30 min后行熱痛覺(jué)過(guò)敏）行為學(xué)檢測(cè)，以D8 MWT和TWL均降低至≤70%基礎(chǔ)值為模型制備成功（本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒β省?4.4%，造模成功后n=18）。于D12行為學(xué)檢測(cè)后30 min處死大鼠，取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，用于后續(xù)Western印跡、RT-PCR和ELISA檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1B）。

Fig.1 Experimental procedure.A：the normal male SD rats were intrathecally injected（it）with scrambled shRNA（shscr group）or Peli1 shRNA（shPeli1 group）once daily from the 2ndday after intrathecal catheterization（D2）to D4.Mechanical allodynia and heat hyperalgesia were evaluated via the mechanical withdrawal threshold（MWT）and thermal withdrawal latency（TWL）on D4，D6，D8，D10 and D12（n=6）.The rats were sacrificed 30 min after the detection of behavior on D12，and the L4-L5 spinal cord was removed for the assays of Western blotting and RT-PCR（n=3）.B：the normal male SD rats were randomly divided into normal control group，CINP group，CINP+shscr group and CINP+shPeli1 group after intrathecal catheterization（n=18）.Rats were injected intrathecally with lentivirus expressing shscr 10 μL and shPeli1 10 μL（2×108TU）once daily from D2 to D4 in CINP+shscr group and CINP+shPeli1 group，respec?tively.Vincristine 125 mg·kg-1was ip injected on four alternate days from D5 in the remaining groups except the normal control group.The behavior detection of mechanical allodynia and heat hyperalgesia was performed on D4，D6，D8，D10 and D12，respectively（n=6）.The rats were sacrificed 30 min after the detection of behavior on D12，and L4-L5 spinal cord segments were taken for subsequent assays.

1.6 機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏行為學(xué)檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)［21］方法，用Von frey纖維絲按克數(shù)由小到大的順序依次垂直刺激大鼠后足底中部，力度以纖維輕微彎曲為準(zhǔn)，持續(xù)3～5 s，直到大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)，同一克數(shù)的纖維絲重復(fù)測(cè)試3次，每次間隔5 min，引起大鼠縮足反應(yīng)的最小纖維絲克數(shù)即為機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。以u(píng)p-down法推測(cè)大鼠MWT，中位數(shù)法計(jì)算50%反應(yīng)閾值，以反映大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。

參照文獻(xiàn)［22］方法，將大鼠置于厚3 mm的玻璃板上適應(yīng)環(huán)境15 min，用熱輻射刺激儀照射大鼠后肢足底中部（刺激強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持一致），照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)縮足或舔足的時(shí)間為熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL），每只大鼠測(cè)定5次，每次間隔3 min，計(jì)算平均TWL反映大鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏。為避免組織損傷，最長(zhǎng)照射時(shí)間設(shè)為20 s。

1.7 Western印跡法檢測(cè)脊髓Peli1，Iba1和GFAP蛋白表達(dá)水平及p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組各取3只大鼠，處死后冰上迅速取出L4～L5脊髓節(jié)段，加入裂解液進(jìn)行勻漿，4℃下17 888×g離心5 min，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每份樣品取30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉2 h，加入一抗（稀釋倍數(shù)：GAPDH，p38 MAPK，JNK和 ERK1/2 為 1∶1000；Peli1，GFAP，Iba1，p-p38 MAPK，p-JNK和p-ERK1/2為1∶2000），4℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（1∶1000）室溫孵育后洗膜、顯色、曝光、顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值或磷酸化蛋白條帶與其總蛋白條帶積分吸光度比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平或蛋白磷酸化水平。

1.8 RT-PCR檢測(cè)脊髓Peli1，Iba1和GFAP mRNA表達(dá)水平

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組各取3只大鼠，處死后取L4～L5脊髓，使用TRIzol?試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。用2-ΔCt法計(jì)算Peli1，Iba1和GFAP mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Sequence of primers for RT-PCR

1.9 免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)脊髓組織切片Iba1蛋白表達(dá)

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組取3只大鼠，麻醉后迅速取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，4%多聚甲醛固定2 h后分別于20%和30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片機(jī)切片（厚度15 μm）。免疫熒光染色：PBS 0.01 mol·L-1（pH7.4）洗片 3 次，每次20 min，加5%山羊血清室溫封閉2 h后加山羊抗大鼠Iba1抗體（1∶200），4℃孵育過(guò)夜；次日復(fù)溫至室溫后PBS洗3次，每次15 min；分別加入CY3標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（1∶1000），室溫孵育2 h；PBS洗3次，每次20 min；晾干，封片劑封片；倒置熒光顯微鏡下拍照觀察。每只大鼠隨機(jī)選擇4張脊髓切片使用Image J軟件計(jì)算各組熒光強(qiáng)度值反映Iba1蛋白表達(dá)水平。

1.10 ELISA檢測(cè)脊髓勻漿TNF-α，IL-6和IL-1 β含量

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組大鼠取3只斷頭處死，迅速冰上取出L4-L5脊髓節(jié)段并勻漿，4℃，7155×g 離心10 min，取上清液，-80℃保存。TNF-α，IL-6和IL-1β含量測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用NK3酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)480 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α，IL-6和IL-1β含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 敲減脊髓Peli1對(duì)正常大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏的影響

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，正常大鼠shscr組和shPeli組鞘內(nèi)置管術(shù)后D4，D6，D8，D10和D12 MWT（圖2A）和TWL（圖2B）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.2 Effect of spinal Peli1 knockdown on mechanical allodynia（A）and heat hyperalgesia（B）in normal rats.See Fig.1A for the rat treatment.MWT：mechanical with?drawal threshold in mechanical allodynia test；TWL：thermal withdrawal latency in heat hyperalgesia test.±s，n=6.

2.2 敲減脊髓Peli1對(duì)正常大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響

Western印跡法（圖3A）和RT-PCR（圖3B）結(jié)果顯示，與shscr組相比，shPeli1組大鼠鞘內(nèi)置管后D12脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.05）。

Fig.3 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Peli1 in spinal cords of normal rats by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1A for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s.n=3.＊P<0.05，compared with shscr group.

2.3 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏的影響

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，對(duì)正常對(duì)照組、CINP組、CINP+shscr組、CINP+shPeli1組大鼠的行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，分組和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)存在交互效應(yīng)（P<0.01）；鞘內(nèi)置管術(shù)后D8，D10和D12，與正常對(duì)照組相比，CINP組大鼠MWT和TWL均顯著降低（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠MWT和TWL明顯增加（P<0.05，P<0.01）。

Fig.4 Effect of spinal Peli1 knockdown on mechanical allodynia(A)and heat hyperalgesia(B)in CINP model rats.See Fig.1B for the rat treatment.±s,n=6.＊＊P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with CINP+shscr group.

2.4 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)的影響

Western印跡法和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，與正常對(duì)照組相比，CINP組大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Peli1蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

Fig.5 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Peli1 in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

2.5 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA的影響

Western印跡法、RT-PCR和免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，與正常對(duì)照組相比，CINP組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.01）。

Fig.6 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Iba1 in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A），RT-PCR（B）and immunofluorescence chemistry（C）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 and C2 were the semi-quantitative results of A1 and C1，respectively.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

2.6 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠脊髓GFAP蛋白和mRNA表達(dá)的影響

Western印跡法和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，各組大鼠脊髓GFAP蛋白及mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.7 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of GFAP in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.

2.7 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

Western印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，與正常對(duì)照組相比，CINP組大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

2.8 敲減脊髓Peli1對(duì)CINP模型大鼠脊髓TNF-α，IL-6和IL-1 β含量的影響

ELISA結(jié)果（圖9）顯示，與正常對(duì)照組相比，CINP組大鼠脊髓組織血漿中TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓組織血漿中TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

Fig.9 Effect of spinal Peli1 knockdown on contents of tumor necrosis factor α（TNF-α）（A），interleukin-6（IL-6）（B）and IL-1 β（C）in spinal cords of CINP model rats detected by ELISA.See Fig.1B for the rat treatment.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

3 討論

本研究采用文獻(xiàn)［20］方法構(gòu)建CINP大鼠模型，該模型具有可操作性強(qiáng)、易于模擬及與CINP臨床特征相似等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)藥物有效性和安全性以及探討CINP發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究中。本研究于術(shù)后D4，D6，D8，D10和D12采用行為學(xué)方法評(píng)價(jià)機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏，結(jié)果顯示，D8 MWT和TWL均降低至≤70%基礎(chǔ)值并持續(xù)到本研究觀察結(jié)束（D12），提示CINP模型制備成功。

RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域重大的發(fā)現(xiàn)之一，是指小分子雙鏈RNA特異性地降解同源mRNA或抑制其表達(dá)，從而抑制或關(guān)閉特定基因功能的現(xiàn)象，該技術(shù)為本研究闡明CINP機(jī)制提供可靠的靶向干預(yù)工具。本研究結(jié)果顯示，與shscr組相比，shPeli組大鼠鞘內(nèi)置管后D12，脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，MWT和TWL無(wú)顯著差異，提示敲減正常大鼠脊髓Peli1并未誘發(fā)痛覺(jué)過(guò)敏。另外，與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，MWT和TWL明顯降低，提示脊髓靶向敲減Peli1的RNA干擾技術(shù)有效可靠；脊髓Peli1基因在CINP發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

目前，CINP發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不清楚，現(xiàn)有藥物療效不佳且長(zhǎng)期應(yīng)用下不良反應(yīng)明顯，令患者無(wú)法耐受。因此，亟需闡明CINP發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為新的有效治療藥物的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。大量證據(jù)表明，膠質(zhì)細(xì)胞在CINP發(fā)生發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［24］。我們及其他團(tuán)隊(duì)研究表明，在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)CINP形成過(guò)程中，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)CINP大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏［25-26］。本研究結(jié)果表明，CINP模型組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，而GFAP蛋白和mRNA表達(dá)水平在各組間均無(wú)明顯差異。文獻(xiàn)報(bào)道，與疼痛密切相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞在CINP形成階段發(fā)揮作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在CINP維持階段發(fā)揮作用［27-28］。本研究時(shí)間范圍（D4～D12）正處于CINP形成階段，提示與星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在CINP形成過(guò)程中可能發(fā)揮更為重要的作用。

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)神經(jīng)病理性痛的分子機(jī)制研究一直備受關(guān)注。目前已研究證實(shí)，CC類趨化因子配體 2［29］和集落刺激因子 1［30］等均可激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞而導(dǎo)致神經(jīng)病理性痛，但是在CINP形成過(guò)程中，Peli1基因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。王林等［16］研究表明，在慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型中，預(yù)先鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1，小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP蛋白和mRNA表達(dá)于術(shù)后D7均明顯下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)置管后D12，與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，而脊髓GFAP蛋白和mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異，提示Peli1基因可作為脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的新分子機(jī)制。本研究與王林等［16］研究結(jié)果在脊髓GFAP表達(dá)方面存在差異，可能與2個(gè)實(shí)驗(yàn)中采用的CINP模型、GFAP檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)和使用的動(dòng)物種屬不同有關(guān)，同時(shí)提示在化療藥物和坐骨神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致的CINP中，Peli1基因的作用可能存在差異，即Peli1基因通過(guò)激活不同膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮作用。

Peli1是一種E3泛素連接酶，可作為模式識(shí)別受體（patern recognition receptor）信號(hào)，調(diào)控先天免疫反應(yīng)［31-32］。最近研究表明，Peli1通過(guò)激活Toll樣受體和T細(xì)胞受體促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子合成［13］。炎癥細(xì)胞因子在慢性疼痛中樞敏化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［33-34］。神經(jīng)損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放的炎癥細(xì)胞因子如TNF-α，IL-6和IL-1β，可與感覺(jué)神經(jīng)元表面受體結(jié)合，增加神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)痛覺(jué)過(guò)敏［35-36］。Peli1通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受相關(guān)的痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞因子合成和釋放表達(dá)上調(diào)［17］。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1后，CINP模型大鼠MWT和TWL明顯增加，脊髓TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)，提示Peli1可能通過(guò)炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)神經(jīng)元敏化，從而促進(jìn)CINP的發(fā)生發(fā)展。

MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激（如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞黏附等）激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，將外界信號(hào)經(jīng)細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞核內(nèi)部。有研究報(bào)道，在神經(jīng)損傷的情況下，脊髓背角MAPK信號(hào)通路包括ERK，p38和JNK被激活［37-39］。另一項(xiàng)研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，Peli1基因缺失抑制脂多糖誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)的激活［13］。小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Peli家族成員Peli1通過(guò)髓系分化88依賴途徑參與MAPK激活，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放［14，40］。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1，可使CINP模型大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2磷酸化水平下調(diào)，脊髓TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)，提示Peli1可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放，進(jìn)而促進(jìn)CINP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，敲減脊髓Peli1可明顯抑制長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的CINP，其機(jī)制可能與抑制大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化及MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。