“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法干預(yù)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的作用機(jī)制*

王盛隆 劉海鑫 董愛(ài)愛(ài) 白 麗 陳慧婷 劉 靈 張亞妮 范嘉琦

（1.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原 030013；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

目前全球約有3.34億支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）患者，預(yù)計(jì)2025年全球哮喘患者將增至4億［1］。根據(jù)傷殘調(diào)整壽命年，哮喘位于所有疾病第14位［2］。該病已成為全球造成巨大社會(huì)經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療負(fù)擔(dān)的疾病之一。因此，提高哮喘的診治水平對(duì)改善哮喘的整體控制和預(yù)后以及降低醫(yī)療成本均有重要意義。

哮喘主要以慢性氣道炎癥及氣道重塑為主要病理特征，反復(fù)發(fā)作使炎性細(xì)胞及某些結(jié)構(gòu)細(xì)胞釋放的炎癥因子及趨化因子使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常，導(dǎo)致“炎癥-上皮細(xì)胞損傷-氣道重塑”的惡性循環(huán)過(guò)程，而氣道重塑是導(dǎo)致哮喘患者肺功能快速下降及固定性氣流受限的主要原因。因此，哮喘的治療不僅要緩解持續(xù)存在的氣道炎癥，更要預(yù)防氣道重塑的發(fā)生。本研究意在探討“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法干預(yù)支氣管哮喘小鼠NLRP3、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、POSTN、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達(dá)及BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EO%及NEU%，闡明該法對(duì)哮喘氣道炎癥及氣道重塑的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C雌性小鼠40只，SPF級(jí)、6～8周齡、體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0004。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：2020DW012），符合倫理委員會(huì)相關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥復(fù)方（熟地黃20 g，當(dāng)歸12 g，陳皮 10 g，清半夏9 g，茯苓 16 g，黨參18 g，阿膠10 g，款冬花12 g，川芎8 g，炙甘草6 g），按每日成人口服生藥量水煎濃縮為0.91 g/mL，由山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，0.75 mg/片）。

1.3 試劑與儀器

Trizol（Invitrogen）、TIANScript RT KIT（天根生化科技有限公司）、Mouse IL-1β ELISA KIT及Mouse TGF-β1 ELISA KIT（博士德生物工程有限公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、LPS（Sigma Corporation of America）及 OVA（Sigma Corporation of America）。生物分光光度計(jì)（Bio Photometer，Eppendorf）、熒光定量 PCR 儀（ABI7500，Applied Biosystems）、壓縮型霧化吸入機(jī)（PARI BOY N 085，PARI GmbH）及光學(xué)顯微鏡（CX31，Olympus Corporation）。

1.4 模型制備

參考農(nóng)光民等［3-4］造模方法并經(jīng)改良：分別于實(shí)驗(yàn)第0、6、13天將小鼠用乙醚麻醉，迅速以10 μL移液槍吸取5 μL致敏液（50 mL PBS+1 mg LPS+1 g OVA）鼻腔內(nèi)滴入致敏；于實(shí)驗(yàn)第21天開(kāi)始將小鼠置于自制霧化箱中以1%OVA溶液霧化吸入連續(xù)激發(fā)14 d，每次60 min?？瞻捉M用等量0.9%氯化鈉溶液致敏與激發(fā)。

1.5 分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組5組，每組8只。每次激發(fā)前30 min開(kāi)始給藥。中藥組給予“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥復(fù)方水煎濃縮液，以18.2 g/kg灌胃；西藥組給予醋酸地塞米松片藥液0.4 mg/kg灌胃，中西結(jié)合組給予中西藥物分別灌胃，劑量同中藥組和西藥組；模型組與空白組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組連續(xù)給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

給藥第14天激發(fā)1 h后從小鼠眼球取血，血液樣本放入1.5 mL離心管中，室溫凝固2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清至新的離心管；然后從小鼠頸部氣管會(huì)厭軟骨下方切一倒“T”型切口，將12G幼鼠灌胃針插入氣管，并用手術(shù)線結(jié)扎固定，迅速打開(kāi)小鼠胸腔，用手術(shù)縫合線迅速結(jié)扎右主支氣管，同時(shí)暴露左肺，抽取BALF置于細(xì)胞固定液中；取右肺上中葉置于液氮中保存。

1.6.1 BALF中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞百分比（EO%）、中性粒細(xì)胞百分比（NEU%） 將裝有BALF的細(xì)胞固定液充分混勻，用移液管將BALF滴入血球計(jì)數(shù)板中，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)白細(xì)胞總數(shù)，紅細(xì)胞、脫落的上皮細(xì)胞、纖毛、雜質(zhì)均不得計(jì)入；將剩余BALF重懸浮，取100 μL BALF重懸液在玻片以上700 r/min離心2 min進(jìn)行甩片，行瑞氏-吉姆薩染色，待干燥后中性樹(shù)膠封片，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，光學(xué)顯微鏡下計(jì)算EO%及NEU%。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)血清中TGF-β1、IL-1β的表達(dá)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6.3 RT-PCR法檢測(cè)肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達(dá) 用Trizol提取組織樣本中總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性；用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)參數(shù)：變性為95℃10 s，退火為58℃30 s，延伸為72℃30 s各1次，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束；用熒光定量PCR儀采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類百分比比較

見(jiàn)表2。與空白組相比，模型組、中藥組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EO%及NEU%明顯升高（P＜0.05），西藥組和中西結(jié)合組則白細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯升高（P＞0.05），EO%及NEU%顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組均明顯下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組白細(xì)胞總數(shù)、EO%及NEU%明顯下降（P＜0.05）。

表2 各組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類百分比比較（±s）

表2 各組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類百分比比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥組比較，▲P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8白細(xì)胞總數(shù)（×104/mL）143.40±42.41 483.80±59.39*331.80±48.87*#201.80±82.26#▲123.80±34.21#▲△EO（%）0.64±0.13 11.10±1.49*8.01±1.19*#5.89±0.62*#▲3.68±0.43*#▲△NEU（%）1.48±0.32 37.50±5.59*20.05±1.62*#15.06±1.21*#▲10.95±1.14*#▲△

2.2 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達(dá)水平比較

見(jiàn)表3。與空白組相比，模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組、西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8 TGF-β1 204.10±11.55 967.85±39.96*629.69±26.76*#588.40±17.92*#▲357.91±43.73*#▲△IL-1β 209.41±9.37 511.89±25.66*404.82±15.60*#364.14±15.90*#▲303.69±13.13*#▲△

2.3 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)比較

見(jiàn)表4。與空白組相比，模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組、西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8 POSTN 0.74±0.56 6.95±0.82*3.75±0.51*#2.87±0.47*#▲2.02±0.44*#▲△NLRP3 0.99±0.30 10.63±1.15*6.04±0.82*#4.13±0.91*#▲2.47±0.56*#▲△MMP-9 0.92±0.16 9.95±0.61*6.72±0.65*#4.10±0.57*#▲2.25±0.41*#▲△MMP-2 0.83±0.19 9.03±0.24*5.95±0.56*#3.86±0.41*#▲1.93±0.47*#▲△

3 討 論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇。哮喘反復(fù)發(fā)作，損傷氣道；且久病耗氣傷津，痰濁膠固，壅塞肺絡(luò)，氣血不暢，痰瘀互結(jié)，這種“因虛致瘀、虛實(shí)夾雜”的病理特征使病情纏綿難愈，與哮喘氣道易感性增加，黏膜腫脹、充血，炎性分泌物滲出，導(dǎo)致氣道痙攣狹窄，缺血缺氧，黏膜瘀血水腫，破壞氣道的結(jié)構(gòu)及功能，支氣管平滑肌增生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而致氣道重塑的認(rèn)識(shí)有相通之處。國(guó)醫(yī)大師洪廣祥提出“痰瘀伏肺為哮證夙根”。張士卿則主張哮喘治療中扶正固本與痰瘀同治是長(zhǎng)期控制哮喘的關(guān)鍵。清·沈金鰲《雜病源流犀燭》于治肺病之法提出“血生脾，統(tǒng)于心，藏于肝，宣布于肺，根于腎”，即肺腎兩臟主血也可病血的觀點(diǎn)。蓋以唯有血液充盈敷濡于肺，肅殺金性始得陰配而治節(jié)之令自調(diào)。一旦血虛失養(yǎng)，則既可乏陰津之源，又可澀肺宇之脈，也可血不養(yǎng)金而肺失濡潤(rùn)或瘀血留客，乃至宣肅違和失節(jié)而哮喘以生。由此可見(jiàn)，久病多虛多瘀，課題組提出“臟虛血弱、痰瘀互結(jié)”為哮喘反復(fù)發(fā)作核心病機(jī)，治療總以“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”為主。本研究方藥由“金水六君煎”化裁而來(lái)。熟地黃甘溫填精補(bǔ)血、培補(bǔ)下元而定喘。當(dāng)歸養(yǎng)血和血，理血中氣，合地黃補(bǔ)陰以配陽(yáng)，使血和氣降；然“當(dāng)歸補(bǔ)血而主動(dòng)”，謂其活血化瘀之效，配以阿膠養(yǎng)血滋陰、化痰清肺；川芎活血行氣，化痰、瘀之窠臼，解阿膠之黏膩；黨參補(bǔ)肺益氣健脾，配甘淡滲濕之茯苓更能發(fā)揮補(bǔ)氣健脾之功，可“培土生金”；清半夏燥濕化痰、消痞散結(jié)。痰之結(jié)由于氣機(jī)不運(yùn)，陳皮芳香醒脾，疏利氣機(jī)，使脾陽(yáng)運(yùn)而濕痰去，氣機(jī)暢而凝滯除；款冬花潤(rùn)肺下氣、化痰止咳；炙甘草和中健脾，調(diào)和諸藥。研究表明，“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”類中藥可以通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)阻斷NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］。藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)肺益腎藥不僅具有抗炎、化痰、解痙平喘作用，同時(shí)能提高細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗邪能力［6］；養(yǎng)血活血類中藥可以減輕哮喘氣道炎性浸潤(rùn)，降低TGF-β1及MMP-9的表達(dá)［7］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）及細(xì)胞組分參與，多種炎性因子、炎癥通路參與其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中以Th2為主的免疫反應(yīng)占主導(dǎo)地位，POSTN是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以與整合素-αVβ1、αVβ3、αVβ5、α6β4和 αMβ2結(jié)合激活信號(hào)通路，而POSTN已被證實(shí)在哮喘患者中高表達(dá)［8］。當(dāng)變應(yīng)原侵入宿主觸發(fā)2型免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞因子IL-13刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生、誘導(dǎo)POSTN高表達(dá)［9］，POSTN通過(guò)與受體相互作用，激活NF-κB/TGF-β，增加嗜酸性粒細(xì)胞的募集，誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，加速氣道炎癥的發(fā)生；與此同時(shí)，信號(hào)通路激活后，通過(guò)MMP-2和MMP-9增強(qiáng)了活化的TGF-β的水平并調(diào)節(jié)膠原蛋白合成及其彈性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積和氣道重塑［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥不僅可以降低哮喘小鼠肺組織中POSTN、MMP-9及MMP-2 mRNA的表達(dá)，同時(shí)可以降低哮喘小鼠血清中TGF-β1的表達(dá)，減少BALF中EO%，提示該法可能通過(guò)阻斷NF-κB/TGF-β通路而發(fā)揮作用。

與此同時(shí)，基于哮喘細(xì)胞表型研究，人群歸因危險(xiǎn)度分析顯示多達(dá)50%以上的哮喘患者為非嗜酸性粒細(xì)胞哮喘，其中以中性粒細(xì)胞型哮喘最為多見(jiàn)［11］。NLRP3炎癥小體是目前研究較多的炎癥小體，由胞內(nèi)固有免疫受體NLRP3、接頭蛋白ASC和蛋白酶Caspase-1作為核心組成的多蛋白復(fù)合物，是氣道中表現(xiàn)出來(lái)的最佳特征性亞型，在慢性疾病（如哮喘）的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［12-14］。當(dāng)各種病原微生物、過(guò)敏原及損傷因素一旦激活NLRP3炎癥小體，ASC作為“橋接蛋白”將活化后的NLRP3與Caspase-1相結(jié)合使其活化?；罨蟮腃aspase-1將pro-IL-1β裂解、分化，成為成熟的IL-1β。IL-1β可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、維持Th17相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生［15］。Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子能夠?qū)χ行粤＜?xì)胞進(jìn)行募集、活化并抑制其凋亡［16］，被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明，“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法不僅可以減少哮喘小鼠肺組織中NLRP3的表達(dá)，同時(shí)可以減少哮喘小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、NEU%、EO%及血清中IL-1β的表達(dá)，提示該法在干預(yù)哮喘發(fā)病的混雜因素中發(fā)揮著一定的作用。

氣道炎癥及氣道重塑是支氣管哮喘治療中永恒不變的話題。從機(jī)制來(lái)看，本研究結(jié)果顯示，“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法能夠減少哮喘BALF中白細(xì)胞總數(shù)，抑制EO%、NEU%和血清中TGF-β1、IL-1β的表達(dá)及肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達(dá)，由此提示，“補(bǔ)肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法可能通過(guò)抑制哮喘炎癥因子釋放、炎癥細(xì)胞募集及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，從而減輕哮喘氣道炎癥及氣道重塑；從療效來(lái)看，中西結(jié)合療效更為顯著。