高頻電針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠血清VIP、MTL表達(dá)及內(nèi)臟敏感性的影響*

劉偉偉 丁 麟 王秀艷 王曉燕

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第960醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250300）

腸易激綜合征（IBS）是衰弱性胃腸功能紊亂疾病，影響了全球約9%～23%的人口［1］。盡管IBS患病率較高，但其確切的病理生理學(xué)原因仍然未知，因此探究IBS的致病機(jī)理及治療方法具有重要意義。電針療法是用電針器輸出脈沖電流，通過毫針作用于機(jī)體經(jīng)絡(luò)穴位治療疾病，具有簡便、可重復(fù)、副作用少等優(yōu)點(diǎn)［2］。血管活性腸肽（VIP）是在免疫細(xì)胞以及胃腸道腸神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，這些神經(jīng)元支配腸上皮離子調(diào)節(jié)、流體分泌和腸道內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡［3］。在結(jié)腸炎IBS大鼠模型中，其血漿VIP濃度高于正常大鼠，猜測VIP可能與IBS的發(fā)病過程［4］。胃動(dòng)素（MTL）是一種由M細(xì)胞分泌的多肽，存在于十二指腸和上段空腸，因刺激胃體運(yùn)動(dòng)得名［5］。劉雪松等［6］發(fā)現(xiàn)腹瀉型IBS大鼠模型血漿MTL水平高于正常大鼠，可能與IBS有關(guān)。本研究通過檢測高頻電針對腹瀉型IBS大鼠血清VIP、MTL表達(dá)及內(nèi)臟敏感性的影響，探究其作用機(jī)制，以期為臨床治療IBS提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量150～180 g，由北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0002，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（京）2019-0032。動(dòng)物質(zhì)量合格證號：CL701309。所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為60%。

1.2 藥物及試劑 番瀉葉（北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，批號：20191127）；匹維溴銨片（法國Abbott HealthcareSAS公司，規(guī)格：50mg/片，批號：B14202013597）；生理鹽水（甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號：2062020317）；MTL、VIP酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELSIA）試劑盒（上海拜沃生物科技有限公司，批號：11122104、E11122105）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡（江南光學(xué)儀器公司，型號：XS-212-202）；華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號：0.20 mm×13 mm）；二導(dǎo)HAN′S穴位刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，型號：LH202H）。

1.4 分組與造模 適應(yīng)性飼喂1周后隨機(jī)選取10只大鼠作為對照組，其他大鼠均予以番瀉葉煎劑（濃度0.3 g/mL）灌胃（20 mL/kg），每日灌胃給藥2次，連續(xù)灌服2周，每次給藥后1 h，用透明膠帶捆綁住大鼠的胸部、肩部和前肢，束縛1 h進(jìn)行造模［7］。造模成功標(biāo)志：初期煩躁不安，容易被激怒，3 d后活動(dòng)量下降，精神萎靡不振，體質(zhì)量下降，食欲減退，排稀便，倦怠少動(dòng)，皮毛干燥無光澤［7］。本次實(shí)驗(yàn)共造模30只，死亡率0%。將造模成功大鼠分為模型組、西藥組和電針組，每組10只。對照組大鼠正常飼養(yǎng)。

1.5 干預(yù)方法 1）西藥組。給予25 mg/kg匹維溴銨灌胃（濃度2.5 mg/mL，灌胃體積10 mL/kg）［9］，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。2）電針組。穴位選?。?］：“足三里”穴（即大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨小頭下5 mm處）、“天樞”穴（即大鼠胸骨柄上緣至外生殖器連線3/4旁開5 mm處）。操作方法：軟布套固定大鼠，將電針正負(fù)極間隔約1 mm刺入同一穴位，調(diào)節(jié)電針儀疏密波頻率為100 Hz，強(qiáng)度0.3 mA，以大鼠肢體微微顫動(dòng)為準(zhǔn)。電針治療每次持續(xù)20 min，隔1 d治療1次，治療2周。3）模型組和對照組大鼠僅軟布套固定20 min，給予等量的生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 1）體質(zhì)量：治療結(jié)束后稱量所有大鼠體質(zhì)量。2）腹部回撤反射（AWR）容量閾值檢測：經(jīng)過2周治療后，注射1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100g）麻醉，使用經(jīng)石蠟潤滑的兒童導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入直腸，氣囊末端距肛門約1 cm。使用膠帶將大鼠尾巴和導(dǎo)管纏住，固定氣囊。然后將大鼠放置于大鼠固定器（20 cm×6 cm×8 cm）內(nèi)，使大鼠不能轉(zhuǎn)身，等待大鼠蘇醒并適應(yīng)環(huán)境，向氣囊注入生理鹽水（26～28℃），每次直腸擴(kuò)張持續(xù)20 s，觀察引起大鼠腹部抬起及背部拱起的AWR的容量閾值。2）ELISA法檢測大鼠血清VIP、MTL表達(dá)水平：AWR試驗(yàn)結(jié)束后再次注射1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血3 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，保存上層血清，采用ELISA方法檢測大鼠血清中VIP、MTL表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。3）HE染色觀察大腸組織：取大鼠結(jié)腸組織放置于4%多聚甲醛溶液固定，制備石蠟切片，在二甲苯中固定30 min，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別脫水5 min；蒸餾水沖洗后，加入蘇木素染色10 min，隨后置于1%鹽酸5 s，蒸餾水進(jìn)行沖洗。滴加伊紅染液進(jìn)行復(fù)染5 min，在不同濃度的乙醇溶液中脫水2 min，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)有差異進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 對照組大鼠精神狀態(tài)較好，飲食及大小便正常。模型組大鼠初期表現(xiàn)出煩躁易怒，不停吼叫，3 d后大鼠活動(dòng)量減少、木訥，飲食飲水減少，體質(zhì)量減輕，精神狀態(tài)欠佳，反應(yīng)遲鈍，背毛干枯發(fā)黃、失去色澤，糞便稀黏。西藥組與電針組大鼠活動(dòng)量增加，精神恢復(fù)，飲食飲水增多，體質(zhì)量增加，大便正常，兩組表現(xiàn)無明顯差異。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較 見表1。與對照組相比，模型組體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、電針組體質(zhì)量均升高（P＜0.05），西藥組與電針組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別對照組模型組西藥組電針組n 10 10 10 10體質(zhì)量228.47±16.37 212.56±12.28*218.73±14.28△219.32±14.53△

2.3 各組大鼠AWR的容量閾值的比較 見表2。與對照組相比，模型組大鼠腹部抬起、背部拱起的AWR的容量閾值降低（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、電針組大鼠腹部抬起、背部拱起的AWR的容量閾值均升高（P＜0.05）；電針組與西藥組腹部抬起、背部拱起的AWR的容量閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠AWR容量閾值的比較（mL，±s）

表2 各組大鼠AWR容量閾值的比較（mL，±s）

組 別 行為反應(yīng)AWR的容量閾值對照組（n=10）模型組（n=10）西藥組（n=10）電針組（n=10）腹部抬起背部拱起腹部抬起背部拱起腹部抬起背部拱起腹部抬起背部拱起0.66±0.11 1.05±0.18 0.38±0.08*0.65±0.10*0.51±0.09△0.86±0.13△0.50±0.09△0.88±0.14△

2.4 各組大鼠血清VIP、MTL表達(dá)水平的比較 見表3。與對照組相比，模型組血清VIP、MTL水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、電針組血清VIP、MTL水平降低（P＜0.05）；電針組與西藥組血清VIP、MTL水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清VIP、MTL表達(dá)水平的比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清VIP、MTL表達(dá)水平的比較（pg/mL，±s）

組別n VIP MTL對照組模型組西藥組電針組10 10 10 10 1.46±0.17 2.81±0.74*1.65±0.21△1.59±0.19△72.31±10.59 93.12±15.09*74.86±11.52△75.36±11.86△

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的比較 見圖1。對照組大鼠結(jié)腸腺體中杯狀細(xì)胞大小基本整齊，無明顯充血現(xiàn)象；模型組大鼠結(jié)腸腺體形態(tài)不完整，黏液/上皮細(xì)胞脫落，隱窩消融，充血明顯；西藥組及電針組較模型組大鼠腸腺體組織隱窩和絨毛消融現(xiàn)象減少，無充血現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯。

圖1 各組大鼠腸組織病理圖（HE染色，200倍）

3 討 論

IBS是一種胃腸道疾病，患者反復(fù)出現(xiàn)腹痛、腹脹、糞便稠度改變，此外還會出現(xiàn)睡眠不足、頭痛、消化不良、疲勞和抑郁等［10］。電針是指在針灸針上施加脈動(dòng)電流以刺激穴位［11］。裴麗霞等［12］研究發(fā)現(xiàn)，電針治療對IBS模型大鼠改善內(nèi)臟敏感度有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后，與模型組相比，西藥組、電針組體質(zhì)量均升高。這提示匹維溴銨和電針治療均能改善大鼠IBS情況，促進(jìn)大鼠體質(zhì)量恢復(fù)。鄧多喜等［13］發(fā)現(xiàn)，電針治療IBS大鼠后，內(nèi)臟高敏反應(yīng)性降低，中腹部抬高和臀部抬高容量閾值升高明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后，西藥組、電針組腹部抬起、背部拱起的AWR的容量閾值較模型組升高。這提示電針治療提高了腹瀉型IBS大鼠腹部抬起、背部拱起AWR容量閾值，可能作為臨床治療IBS的重要手段。

VIP是一種堿性多肽，廣泛分布于胃腸道及胰腺和神經(jīng)系統(tǒng)，可促進(jìn)腸道水和電解質(zhì)的分泌，在消化道表現(xiàn)為抑制下食管括約肌張力，抑制胃、腸肌張力和膽囊收縮［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者血漿樣品中VIP含量高于健康女性［16］。MTL是消化道分泌激素之一，可以調(diào)節(jié)食管、膽囊、胃腸的運(yùn)動(dòng)，其水平升高可造成腸道蠕動(dòng)速度加快，使腸內(nèi)容物加快通過，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉等癥狀。研究顯示，IBS患者消化期間和進(jìn)餐后其血漿MTL水平高于正常水平［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后西藥組、電針組血清VIP、MTL水平較模型組明顯降低；西藥組與電針組血清VIP、MTL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示血清VIP、MTL可能與IBS的發(fā)生有關(guān)，猜測高水平的VIP使腸道分泌過量水和電解質(zhì)，并造成稀便；高水平的MTL提高胃腸蠕動(dòng)頻率，促進(jìn)胃腸排空，二者共同作用造成腹痛、腹瀉；而電針治療可能通過調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌和釋放調(diào)節(jié)大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能，降低血清VIP及MTL水平。楊大業(yè)等［18］發(fā)現(xiàn)，電針“足三里”穴治療腹瀉型IBS大鼠模型，對恢復(fù)大鼠體質(zhì)量、提高胃排空率等作用明顯，并改善大鼠結(jié)腸形態(tài)，使結(jié)腸黏膜恢復(fù)完整。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸黏液/上皮細(xì)胞脫落，隱窩消融，充血明顯；西藥組及電針組較模型組大鼠結(jié)腸腺體組織隱窩和絨毛消融現(xiàn)象減少，無充血現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯。這提示高頻電針可改善IBS大鼠腸道病情，可能作為治療腹瀉型IBS的新手段。

綜上所述，高頻電針可能通過抑制腹瀉型IBS大鼠血清VIP、MTL的水平，提高大鼠AWR容量閾值，改善大鼠IBS病情。本研究也存在未對VIP、MTL表達(dá)水平進(jìn)行免疫組化檢測的不足，高頻電針對IBS大鼠血清VIP、MTL水平及內(nèi)臟敏感性的影響有待后續(xù)深入研究。