虎杖對(duì)甲型流感病毒FM1感染小鼠肺損傷的干預(yù)作用*

劉國(guó)星 王成祥 徐紅日△ 曹鴻云△ 李 猛劉 暢 于會(huì)勇 程 淼 李雅莉 劉 通

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.陜西省中醫(yī)院，陜西 西安 710003；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

流行性感冒傳染性強(qiáng)、傳播速度快，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有29～65萬(wàn)人死于流感［1］。流感病毒主要分為甲、乙、丙3型，其中甲型流感病毒常發(fā)生變異，對(duì)金剛烷胺、奧司他韋等產(chǎn)生耐藥性，限制了抗病毒藥物的臨床使用。流感屬于中醫(yī)學(xué)“外感熱病”范疇，數(shù)千年來，中醫(yī)藥對(duì)外感熱病的治療具有顯著的臨床效果。

虎杖性微寒，味微苦，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，并能瀉熱通腑［2］。課題組前期研究證實(shí)，臨床效方清肺飲對(duì)病毒性肺炎患者發(fā)熱、咳嗽、咯痰等癥狀的改善和肺部炎癥吸收具有顯著的作用［3］，其治法以清熱解毒、宣肺止咳為核心，虎杖是其中主要藥物之一。該藥被廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒肺炎防治的宣肺敗毒方在縮短患者臨床癥狀消失時(shí)間、體溫復(fù)常時(shí)間、平均住院天數(shù)等方面，具有確切作用，并在阻斷輕型、普通型轉(zhuǎn)重型方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［4］。其治法以辛涼解表、清熱宣肺為核心，其中以虎杖行解毒利濕、化痰通腑之用。因此，本研究以虎杖作為清熱利濕、化痰通腑法的代表藥，觀察其對(duì)小鼠感染流感病毒FM1株后不同時(shí)相肺部炎癥損傷的干預(yù)作用，將為清熱利濕、化痰通腑法增添新的內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/cAnN 小鼠，SPF級(jí)，雄性，16～18 g，共 72只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過了中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審查，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心合格證號(hào)：SYXK（京）2017-0021。

1.2 藥物與試劑

藥物：虎杖顆粒劑（批號(hào)：20000761），購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。試劑：4%多聚甲醛固定液，PBS緩沖液。HE染色試劑盒（索萊寶公司）；TRIzol Reagent［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：94204］，PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào)：AJ91586A］，TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào)：AJG1873A］，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。無(wú)水乙醇、氯仿（分析純，北京化工廠）。流感病毒FM1，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。血凝滴度為1∶512，對(duì)小鼠LD50為10-4.8，-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.3 主要儀器

顯微鏡（OLYMPUS-BX51，日本），掃描電子顯微鏡（日立，S-3400N）。圖像采集系統(tǒng)（OLYMPUS，DP controller 3.1.1.267），Biorad CFX96 qPCR 儀（Bio-rad公司），NanoDrop微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司），超純水儀（Millipore公司），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）。生物安全柜（Ⅱ級(jí)B2型）（美國(guó)NUAIRE公司，型號(hào)：NU-425-600E），電子天平（瑞士METTLER公司，型號(hào)：PB153-S/FACT），高通量組織研磨儀（德國(guó)Qiagen公司，型號(hào)：TissuelyserⅡ），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（新加坡Applied Biosystems B.V公司，型號(hào)：7500 FAST）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1）感染。將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、虎杖組，每組24只。用3%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，空白組以PBS滴鼻，每只25 μL。其余各組以25 μL FM1株病毒懸液滴鼻，感染濃度為10-4。各組滴鼻后按照第1、3、5天不同觀察點(diǎn)隨機(jī)分為3個(gè)小組，每小組8只。2）給藥。根據(jù)文獻(xiàn)［5］，按直接折算法計(jì)算小鼠與人的臨床等效劑量?；⒄冉o藥劑量為3 g/（kg·d），感染2 h后首次給藥，每日灌胃1次，每次給藥0.2 mL，空白對(duì)照組及模型組予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，每次0.2 mL。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1）小鼠肺指數(shù)檢測(cè)。小鼠感染后第1、3、5天取材，計(jì)算肺指數(shù)，記錄肺臟大體病變情況，摘取左肺，在0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。取各組小鼠右肺放入2 mL凍存管中，置液氮中凍存。肺指數(shù)=肺質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。2）小鼠肺組織病理觀察。將固定好的肺組織常規(guī)脫水、包埋、切片、染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病變情況，采用OLYMPUS圖像拍攝系統(tǒng)（OLYMPUSBX51，日本）及OLYMPUS DP controller 3.1.1.267圖像采集系統(tǒng)采集圖片。3）小鼠氣管超微結(jié)構(gòu)觀察。實(shí)驗(yàn)第5日，剪取小鼠氣管5 m，保存于4%戊二醛中，用不銹鋼雙刃刀片切成2 mm厚、1 mm×1 mm大小的組織塊，常規(guī)脫水、干燥、噴金，將制作好的標(biāo)本置于掃描電鏡下觀察。4）RT-PCR檢測(cè)小鼠肺臟中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA、白細(xì)胞介素-1（IL-1）mRNA、白細(xì)胞介素-10（IL-10）mRNA、γ干擾素（IFN-γ）mRNA水平。以GADPH作為內(nèi)控基因，小鼠引物序列見表1。取2 μL RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，將cDNA作為模板進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為初始熱激活95 ℃ 2 min，變性 95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況比較

空白組小鼠麻醉恢復(fù)后反應(yīng)敏捷，毛色有光澤。模型組小鼠感染后第2天開始活動(dòng)減少、進(jìn)食減少，扎堆聚集，毛色黯淡，逐漸全部表現(xiàn)出精神不振、蜷縮、消瘦?；⒄冉M小鼠第3天開始活動(dòng)減少、進(jìn)食減少，毛色黯淡，有聚堆傾向，逐漸有個(gè)別小鼠出現(xiàn)蜷縮、精神不振。

2.2 各組小鼠肺指數(shù)比較

見表2。流感病毒感染后第3日，模型組小鼠的肺指數(shù)高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第5天模型組較空白組肺指數(shù)進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第3天虎杖組小鼠肺指數(shù)較模型組有降低趨勢(shì)，第5天虎杖組較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠滴鼻感染后各時(shí)間點(diǎn)肺指數(shù)比較（%，±s）

表2 各組小鼠滴鼻感染后各時(shí)間點(diǎn)肺指數(shù)比較（%，±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組虎杖組n 24 24 24第1日0.63±0.04 0.66±0.08 0.65±0.13第3日0.59±0.08 1.17±0.28▲0.95±0.30▲第5日0.61±0.05 1.57±0.58▲▲1.25±0.45▲▲△

2.3 各組小鼠肺組織大體病變比較

空白組肺組織呈現(xiàn)均勻淡粉色，無(wú)充血、水腫及實(shí)變。模型組感染后第1天肺組織散在斑片充血，肺門附近及肺上葉明顯，無(wú)明顯實(shí)變區(qū)。感染后第3天，肺門、肺葉交界附近見暗褐色實(shí)變區(qū)；感染后第5天，肺門及兩個(gè)肺葉以上出現(xiàn)大片暗褐色實(shí)變區(qū)?；⒄冉M小鼠感染后第1天肺組織偶見斑點(diǎn)狀充血，感染后第3天肺組織出現(xiàn)暗褐色實(shí)變，肺門附近為主，感染后第5天肺組織散見實(shí)變區(qū)，較模型組實(shí)變面積小。

2.4 各組光鏡觀察小鼠肺組織微觀病變比較

空白組，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔正常，細(xì)支氣管上皮完整，管腔內(nèi)未見滲出。模型組感染后第1天細(xì)支氣管上皮小部分脫落，管腔內(nèi)見滲出，肺泡隔增厚，有少許中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔內(nèi)充血。感染后第3天細(xì)支氣管上皮脫落，肺泡間隔增厚，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔內(nèi)有紅細(xì)胞。感染后第5天，支氣管上皮脫落，周圍血管內(nèi)充血，多見肺泡融合、間隔增厚，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞大量浸潤(rùn)?；⒄冉M，感染后第1天，部分肺泡融合，肺泡隔增厚，細(xì)支氣管上皮部分脫落，管腔內(nèi)少許滲出，管壁有少許單核細(xì)胞浸潤(rùn)。感染后第3天，肺泡融合加重，肺泡隔增厚；細(xì)支氣管上皮完整，管腔內(nèi)少許滲出，血管內(nèi)充血。感染后第5天，部分肺泡融合、間隔增厚，部分細(xì)支氣管管腔狹窄，管腔內(nèi)炎性滲出較模型組減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織微觀病變（HE染色，100倍和400倍）

2.5 各組小鼠氣管超微結(jié)構(gòu)比較

空白組氣管內(nèi)壁黏膜完整，細(xì)胞飽滿，纖毛密集，纖毛長(zhǎng)而粗細(xì)均勻，排列整齊，纖毛間分布有微絨毛。模型組氣管內(nèi)壁黏膜不完整，細(xì)胞表面扁平，纖毛明顯脫落、變短、倒伏，微絨毛大部分脫落?；⒄冉M纖毛脫落，稀疏，變短，排列紊亂，纖毛間微絨毛片狀脫落。見圖3。

圖3 各組小鼠氣管超微結(jié)構(gòu)（1000倍和3000倍）

2.6 各組小鼠肺組織中TNF-α mRNA、IL-1 mRNA、IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的表達(dá)量比較

2.6.1 各組小鼠肺組織中TNF-α mRNA表達(dá)量的比較 見表3。與空白組比較，模型組和虎杖組肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá)在感染后第1～5天顯著增加（第1天P＜0.05，第3天P＜0.01，模型組第5天P＜0.01）；與模型組比較，虎杖組肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá)在感染后第3、5天有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠肺組織中TNF-α mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠肺組織中TNF-α mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組虎杖組n 24 24 24第1日0.431±0.140 0.551±0.093 0.831±0.188▲第3日0.399±0.103△△1.795±0.741▲▲1.010±0.397△第5日0.545±0.213 0.731±0.155 0.746±0.371

2.6.2 各組小鼠肺組織中IL-1 mRNA表達(dá)量的比較見表4。與空白組比較，模型組肺組織中IL-1 mRNA的表達(dá)在感染后第3天顯著增加（P＜0.01），虎杖組肺組織中IL-1mRNA的表達(dá)在感染后第1天明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，虎杖組肺組織中IL-1 mRNA的表達(dá)在感染后第3天顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肺組織中IL-1mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

表4 各組小鼠肺組織中IL-1mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組虎杖組n 24 24 24第1日0.649±0.129△1.056±0.232▲1.122±0.235▲第3日0.619±0.210△△1.842±0.267▲▲1.799±0.225▲▲第5日0.596±0.105△△1.333±0.363▲▲1.242±0.273

2.6.3 各組小鼠肺組織中IL-10 mRNA表達(dá)量的比較 見表5。與空白組比較，模型組在流感病毒感染后第1～3天肺組織中IL-10 mRNA表達(dá)有降低趨勢(shì)，在感染后第5天有升高趨勢(shì)?；⒄冉M肺組織中IL-10 mRNA表達(dá)在感染后第3～5天與空白對(duì)照組比較有增加趨勢(shì)，感染后第1～3天與模型對(duì)照組比較有增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組小鼠肺組織中IL-10mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

表5 各組小鼠肺組織中IL-10mRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組虎杖組n 24 24 24第1日1.166±0.534 0.961±0.191 0.707±0.138第3日1.151±0.339 1.133±0.511 1.562±1.008第5日1.486±0.536 1.831±0.109 1.777±1.079

2.6.4 各組小鼠肺組織中IFN-γ mRNA表達(dá)量的比較 見表6。與空白組比較，模型組肺組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)在感染后第5天顯著增加（P＜0.05），虎杖組肺組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)在感染后第1、5天顯著增加（P＜0.01和P＜0.05）；與模型組比較，虎杖組肺組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)在感染后第1天顯著增加（P＜0.05）。

表6 各組小鼠肺組織中IFN-γmRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

表6 各組小鼠肺組織中IFN-γmRNA表達(dá)量的比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組虎杖組n 24 24 24第1日0.212±0.066 0.613±0.362 1.109±0.332▲▲△第3日0.242±0.155 0.933±0.221 0.945±0.525第5日0.230±0.070△1.356±0.311▲1.487±0.346▲

3 討 論

重癥流感病毒肺炎主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、肺間質(zhì)和支氣管壁大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征，繼發(fā)多臟器損傷，甚至死亡［6］。炎性因子水平大量升高是引起機(jī)體免疫損傷的基礎(chǔ)，病毒感染能誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α，使局部血管擴(kuò)張、通透性增加，補(bǔ)體、急性期蛋白等隨血漿外滲，并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞，使細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)增加，加強(qiáng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞外滲，釋放一系列炎性介質(zhì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組織病理?yè)p傷［7］。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，能結(jié)合細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，從而提高機(jī)體對(duì)病毒的清除能力［8］?；⒄染哂欣麧裢它S、清熱解毒、散瘀止痛、化痰止咳等功效。虎杖及其活性成分能直接抑制流感病毒的增殖，增加TLR9誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)［9］，并且在感染流感病毒的初期與后期均可減少小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子的分泌［10］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染后第3、5天，虎杖組肺指數(shù)較模型組降低，其中第5天差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)虎杖組小鼠肺組織較模型組病灶小、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度較低。感染后第5天，虎杖組小鼠氣管纖毛及微絨毛較模型組增多。結(jié)果表明虎杖對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織及氣管具有保護(hù)作用。肺勻漿RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，虎杖組感染后第1天IFN-γ mRNA較模型組顯著升高，第3天IL-1 mRNA較模型組顯著降低，第3天IL-10 mRNA表達(dá)較模型組有升高趨勢(shì)，TNF-α mRNA較模型組無(wú)明顯變化。這表明虎杖能通過上調(diào)早期IFN-γ mRNA水平提高機(jī)體的抗病毒能力，下調(diào)感染病程中期IL-1 mRNA的過度表達(dá)，從而減輕了肺組織的炎癥損傷，降低了小鼠的肺指數(shù)。

流感病毒感染屬于中醫(yī)急性外感熱病范疇。外感風(fēng)熱，初起見咳嗽、發(fā)熱、咽痛、口渴，繼而邪熱入里，熱盛成毒，灼津成痰，痰熱互結(jié)，阻滯肺之宣發(fā)肅降，出現(xiàn)咳嗽喘促、痰多難咯，形成痰熱壅肺證［11］，治當(dāng)清熱解毒、宣肺化痰。肺熱不解，易與濕邪相干，使病程進(jìn)展更加復(fù)雜多變?！锻飧袦?zé)帷氛撌觥皾衽c溫合，蒸郁而蒙蔽于上，清竅為之壅塞，濁邪害清也”［12］，提出了邪熱與濕相合，迅速傳變?！稖夭l辨》論述“脾郁發(fā)黃，黃極則諸竅為閉，穢濁塞竅者死”［13］，提出濕熱盤踞中焦，土壅木塞，郁而發(fā)黃；濕熱蘊(yùn)濁，穢濁塞竅，見小便澀滯、神識(shí)昏蒙等危重證候。新冠肺炎患者早期表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽為主，進(jìn)見食欲差、惡心、便溏、腹瀉，舌苔普遍為膩苔，之后快速發(fā)展為痰瘀壅肺、邪毒閉肺、內(nèi)閉外脫等證候，濕、熱、毒、瘀即是其主要證候要素［14］。

《靈樞·本輸》論述“肺合大腸，大腸者，傳道之腑”，提出了肺與大腸密切相關(guān)的認(rèn)識(shí)。肺主一身之氣，肺氣郁閉則腸腑不通，腸道壅滯也會(huì)導(dǎo)致肺氣宣降失常。廖榮鑫等［15］以96例銅綠假單胞菌肺炎患者為研究對(duì)象，對(duì)照組給予常規(guī)西藥治療，治療組在此基礎(chǔ)上給予白虎承氣湯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平均顯著降低，病原菌的清除率顯著高于對(duì)照組。林新鋒等［16］通過對(duì)ICU46例重癥肺炎患者的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上加用調(diào)胃承氣湯較單純西藥組能顯著降低患者血清WBC、CRP、PCT、血清淀粉樣蛋白A（SAA）、IL-6水平，提示調(diào)胃承氣湯可減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，有利于重癥肺炎的早期康復(fù)。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［17］，通腑法能使肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞增多，提高機(jī)體免疫功能，并能增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)，提高新陳代謝、降低腹壓、改善微循環(huán)。

由此可見，外感熱病以熱毒郁肺為主要病理因素，故清熱解毒為首要治則法。熱盛灼津，肺失宣降，痰瘀內(nèi)結(jié)，故以化痰行瘀助氣機(jī)升降。邪熱壅結(jié)上焦，恐有傷及中焦、傳變下焦之勢(shì)，故以利濕法清肝膽、健中焦，先按未受邪之地，防止?jié)衽c熱相膠結(jié)。肺合大腸，表里相連，肺熱壅盛，腸腑失司，傳道不利，故以通腑瀉熱，下開結(jié)滯、上啟化源，亦給邪以出路。綜上所述，虎杖功兼解肺之熱毒、化肺之痰瘀、利肝膽之濕、通大腸之結(jié)，能顯著改善小鼠肺組織病理?yè)p傷。清熱利濕、化痰通腑法在外感熱病治療中具有重要作用，亦能顯著降低促炎因子、升高抗病毒因子，減輕機(jī)體過度的免疫反應(yīng)。