虎地腸溶膠囊對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠黏液屏障損傷修復(fù)的作用研究*

丁龐華 史利卿 石 磊 郭 一 路瓊瓊寇富舜 趙興杰 毛堂友 孫中美 李軍祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是發(fā)生在結(jié)直腸、原因不明的非特異性炎癥性疾?。?］。本病好發(fā)于中青年，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便及腹痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近10年來我國UC患病率（11.6/10萬人）逐年上升，發(fā)病人數(shù)增加了7倍［2-3］，成為當(dāng)前消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前UC的臨床治療藥物主要包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑。但以上藥物可能出現(xiàn)臨床療效不穩(wěn)定、停藥后易復(fù)發(fā)或不同程度的毒副作用。隨著對(duì)UC研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到黏液屏障作為腸道黏膜屏障的第一道防線，在UC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-5］。腸黏液屏障結(jié)構(gòu)減弱是UC發(fā)病的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。UC的炎癥表現(xiàn)與促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的失衡有關(guān)，其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎因子的上調(diào)在此過程中起著重要作用［7］。在UC的發(fā)生發(fā)展過程中，IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致T細(xì)胞過多堆積，加重腸黏膜的慢性炎癥，出現(xiàn)UC的臨床炎癥表現(xiàn)［8］。TNF-α在UC的發(fā)生發(fā)展過程中起到“樞紐樣”作用，已有研究證實(shí)TNF-α參與UC發(fā)展的許多環(huán)節(jié)［9］。

虎地腸溶膠囊作為活動(dòng)期UC治療的代表方藥，在2017年《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見》中被推薦使用［10］。在前期評(píng)價(jià)虎地腸溶膠囊以及聯(lián)合美沙拉嗪腸溶片治療活動(dòng)期UC臨床療效的多中心、隨機(jī)對(duì)照、雙盲雙模擬的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其治療UC療效顯著［11］。因此，本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠UC模型，觀察虎地腸溶膠囊對(duì)UC小鼠腸黏液屏障及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討虎地腸溶膠囊治療UC的作用機(jī)制，從而為其臨床治療UC提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠20只，體質(zhì)量18～20 g，鼠齡7～8周，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（京）2019-0013。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度23～27℃，相對(duì)濕度40%～60%，室內(nèi)通風(fēng)良好，每日光照10～12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法符合北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)程，倫理編號(hào)：BUCM-4-2020082704-3138。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 虎地腸溶膠囊由朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬、二色補(bǔ)血草、地榆、白及、甘草組成（安徽九方制藥，國藥準(zhǔn)字Z20020035，批號(hào)：14000367653），結(jié)合其臨床規(guī)定使用劑量，進(jìn)行人-鼠等劑量換算，使用劑量為0.73 g/kg。美沙拉嗪腸溶片（德國?？酥扑幱邢薰荆?guī)格0.5 g/粒，批號(hào)：H20171358），使用劑量為0.46 g/kg。

1.3 試劑與儀器 DSS（美國MP Biomedicals，43 kDa，批號(hào)：160110），用100 mL滅菌蒸餾水溶解2.5 g DSS配制2.5%的DSS溶液用于實(shí)驗(yàn)；無水乙醇，北京華騰化工有限公司；二甲苯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素、伊紅，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中性樹膠，中國上海標(biāo)本模型廠；阿利新藍(lán)染液套裝（AB-PAS），Servicesbio；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)，貨號(hào)分別為ml06315-J、ml002095-J）。電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)SKP-02.600；病理石蠟包埋機(jī)，沈陽市龍首電子儀器有限公司，型號(hào)LS-100；石蠟切片機(jī)，北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)Finesse 325；顯微鏡，奧林巴斯株式會(huì)社，型號(hào)BX60。

1.4 造模與給藥 20只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予如下處理：空白組普通飼養(yǎng)，每日予滅菌蒸餾水0.2 mL灌胃；模型組予2.5% DSS溶液自由飲用7 d，每日予滅菌蒸餾水0.2 mL灌胃?；⒌啬c溶膠囊組飲水同DSS組，每日予虎地腸溶膠囊溶液0.73 g/kg灌胃；美沙拉嗪組飲水同DSS組，每日予美沙拉嗪溶液0.46 g/kg灌胃。所有小鼠除飲水和灌胃之外，其他飼養(yǎng)條件一致。

1.5 一般情況與疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分 每天觀察并記錄各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛色澤、大便性狀、體質(zhì)量變化、大便潛血情況等。計(jì)算每組小鼠DAI評(píng)分值，DAI=（體質(zhì)量評(píng)分+大便性狀評(píng)分+出血情況評(píng)分）/3。具體評(píng)分準(zhǔn)則如下：體質(zhì)量下降＜1%計(jì)0分，下降1%～5%計(jì)2分，下降10%～15%計(jì)3分，下降＞15%計(jì)4分；大便呈干性顆粒狀計(jì)0分，松散便計(jì)2分，稀便計(jì)4分；大便隱血陰性計(jì)0分，隱血陽性計(jì)2分，肉眼血便計(jì)4分。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察。末次藥物干預(yù)結(jié)束后，使用二氧化碳麻醉小鼠，眼球取血后斷頸處死，分離小鼠結(jié)腸，測量從肛門至回盲部的結(jié)腸長度，然后取結(jié)腸遠(yuǎn)端約1 cm長度，用4%多聚甲醛溶液固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察切片組織學(xué)變化。2）血清中IL-6和TNF-α含量。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測儀按照標(biāo)準(zhǔn)檢測流程檢測小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。3）結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞觀察。截取1 cm左右的病變組織，置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用石蠟包埋，切片，用于AB-PAS染色，光鏡下觀察結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，滿足正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 空白組小鼠第1～7天體質(zhì)量穩(wěn)中有增，排便正常。模型組小鼠給予DSS溶液自由飲用后的第2～3天開始出現(xiàn)大便不成形、大便潛血（+）或肉眼血便等情況，伴體質(zhì)量進(jìn)行性下降?；⒌啬c溶膠囊組、美沙拉嗪組的小鼠，在給予DSS溶液的第2～3天出現(xiàn)大便不成形、大便潛血（+）或肉眼血便等情況，隨著時(shí)間的增加，小鼠體質(zhì)量減輕情況較模型組變緩。

2.2 各組小鼠干預(yù)后DAI評(píng)分比較 見表1。造模4 d后模型組小鼠體質(zhì)量開始出現(xiàn)下降，且全部呈現(xiàn)便血癥狀，大便性狀改變，DAI升高。造模7 d后模型組小鼠體質(zhì)量下降明顯且全部呈現(xiàn)便血、大便性狀改變癥狀。造模后與空白組相比，模型組小鼠DAI顯著升高（P＜0.01），虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組治療后能夠顯著降低UC小鼠DAI（P＜0.01）?；⒌啬c溶膠囊組與美沙拉嗪組之間小鼠DAI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠DAI評(píng)分及結(jié)腸長度比較（±s）

表1 各組小鼠DAI評(píng)分及結(jié)腸長度比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組虎地腸溶膠囊組美沙拉嗪組結(jié)腸長度（cm）9.06±0.56 6.98±0.29*7.50±0.39#7.52±0.21#n 5 5 5 5 DAI評(píng)分（分）0.00±0.00 2.83±0.43*2.13±0.45#2.25±0.32#

2.3 各組小鼠結(jié)腸長度比較 見表1。與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.01）；與模型組相比，虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組治療后能夠改善小鼠結(jié)腸長度（P＜0.05）。虎地腸溶膠囊組與美沙拉嗪組之間小鼠結(jié)腸長度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠組織病理學(xué)變化比較 由圖1可見，空白組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸黏膜未見病變。模型組可見黏膜下隱窩腺體全部消失，炎癥細(xì)胞浸潤黏膜至上皮，腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯破壞?；⒌啬c溶膠囊組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與空白組最為接近。美沙拉嗪組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少。

圖1 各組UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，100倍）

2.5 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平比較 見表2。與空白組比較，模型組IL-6、TNF-α明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療后虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組IL-6、TNF-α明顯降低，接近于空白組（P＜0.05）?；⒌啬c溶膠囊組與美沙拉嗪組中TNF-α的減低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且虎地腸溶膠囊優(yōu)于美沙拉嗪組（P＜0.05）；而IL-6的減低，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05。

TNF-α 63.68±4.19 69.97±4.90*46.16±1.50#△59.92±6.52#組別空白組模型組虎地腸溶膠囊組美沙拉嗪組n 5 555 IL-6 9.62±2.04 16.17±2.15*12.43±2.23#12.78±1.62#

2.6 各組小鼠結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞變化比較 見圖2。空白組小鼠結(jié)腸黏膜的杯狀細(xì)胞密集分布于隱窩兩側(cè)，形態(tài)規(guī)則飽滿。而模型組小鼠結(jié)腸黏膜破損，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，大小不均，較之正常組，具有顯著差異。虎地腸溶膠囊組的杯狀細(xì)胞沿著腺體分布，比較密集，數(shù)量增多，較之模型組有明顯變化。美沙拉嗪組小鼠杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，大小不均，較之模型組無明顯變化。

圖2 各組UC小鼠結(jié)腸黏膜的杯狀細(xì)胞觀察（AB-PAS染色，100倍）

3 討論

根據(jù)UC臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“久痢”等范疇，其病機(jī)多屬濕熱瘀阻、脾氣虛弱。多因外感內(nèi)傷致脾胃運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，郁而化熱，濕熱下注大腸，與腸道氣血相搏結(jié)，氣血凝滯，化為膿血；故患者出現(xiàn)腹瀉，下利黏液膿血便。腸道傳導(dǎo)失司，氣機(jī)阻滯，腑氣不通，故見腹痛，里急后重；脾氣不足，不能運(yùn)化水谷精微，表現(xiàn)為神疲乏力、肢體困倦、食少納差。治療多以清熱化濕、涼血化瘀、健脾益氣為主。

虎地腸溶膠囊由朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬、二色補(bǔ)血草、地榆炭、白及和甘草組成。方中朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬合用可清熱利濕解毒，且可止痛；地榆、白及合用既可涼血收斂止血，也可解毒消腫生肌。二色補(bǔ)血草具有益氣血、散瘀止血之功效，常用于病后體弱、胃脘痛、消化不良、崩漏、帶下、尿血、痔血。甘草性味甘平，可緩急止痛、解毒消癰、調(diào)和諸藥，防止苦寒傷胃，且可補(bǔ)脾胃不足以扶正，二藥合用達(dá)到健脾益氣之功效。虎地腸溶膠囊在臨床中治療輕中度活動(dòng)期UC療效顯著［11］。美沙拉嗪通過抑制結(jié)腸黏膜釋放前列腺素、白三烯等損傷性因子，從而減輕炎癥因子對(duì)腸黏膜的損傷；故選用為本次研究的陽性對(duì)照藥。本研究結(jié)果顯示，虎地腸溶膠囊在改善UC模型小鼠DAI、結(jié)腸長度等方面療效與美沙拉嗪相近。

UC發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能的失衡與其發(fā)病密切相關(guān)。腸黏膜屏障的完整性依賴于正常的免疫反應(yīng)、腸黏膜上皮細(xì)胞（IECs）的完整性和黏液的產(chǎn)生［12-14］。黏液的正常分泌形成了腸道的黏液屏障，黏液屏障在UC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)指出，腸黏液屏障損傷（包括黏液層厚度和通透性異常改變）可導(dǎo)致腸道通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸道致病細(xì)菌更易侵犯腸黏膜引起腸道疾病。UC活動(dòng)期，杯狀細(xì)胞會(huì)明顯減少甚至消失，導(dǎo)致黏蛋白分泌減少，黏液層變薄甚至缺失，暴露出來的上皮細(xì)胞易受細(xì)菌侵襲［15］。有研究者發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的UC模型中，在炎癥發(fā)生之前，糞便中的細(xì)菌會(huì)侵入結(jié)腸黏液層，由此證明DSS能夠直接破壞黏液層，也說明了完整的黏液層對(duì)腸道的保護(hù)作用［16］。

當(dāng)腸黏膜屏障第一道防線腸黏液屏障被破壞時(shí)，IECs暴露在多種抗原刺激下，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，炎癥介質(zhì)不斷積累，對(duì)IECs和自身抗體的毒性作用會(huì)刺激自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸損傷的發(fā)展并形成惡性循環(huán)，這也是UC反復(fù)發(fā)作的原因之一［17］。IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子來源于多種免疫和非免疫細(xì)胞以及IECs自身產(chǎn)生。IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的升高，會(huì)促進(jìn)IECs的凋亡，從而導(dǎo)致屏障功能障礙［18］。UC患者血清中檢測到促炎因子IL-6、TNF-α水平的升高，抗IL-6R抗體和TNF-α阻斷劑已成為臨床中治療UC的重要替代品［19-20］。

本次研究中，DSS致小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低，精神萎靡、腹瀉血便等現(xiàn)象，符合UC的表現(xiàn)，屬于虎地腸溶膠囊的治療范圍。與模型組相比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，結(jié)腸長度偏長，結(jié)腸病理情況有不同程度的改善。各給藥組小鼠結(jié)腸組織較模型組IL-6、TNF-α的合成和釋放減少。模型組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，虎地腸溶膠囊組能夠明顯增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量，而美沙拉嗪組對(duì)杯狀細(xì)胞數(shù)量改善不明顯，這可能是虎地腸溶膠囊發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵所在。

綜上所述，虎地腸溶膠囊能夠有效促進(jìn)UC小鼠的恢復(fù)，回復(fù)腸道形態(tài)，改善其腸道病理損傷。其治療效果可能是通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞的生長，修復(fù)腸黏液屏障，進(jìn)而恢復(fù)腸黏液及黏液屏障功能，并為其他屏障功能的正常發(fā)揮提供基礎(chǔ)；同時(shí)可能通過下調(diào)血清中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的水平，減輕因黏液屏障功能損傷或消失引起的炎癥因子對(duì)腸黏膜直接的炎癥刺激，緩解腸道炎癥反應(yīng)，恢復(fù)腸黏膜功能。此次研究為臨床應(yīng)用虎地腸溶膠囊治療活動(dòng)期UC提供了更多的分子生物學(xué)理論依據(jù)。