13種抗生素對快生長分枝桿菌的體外抑菌效果評價

于霞 任汝顏 文舒安 梁倩 董玲玲 黃海榮

快生長分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria，RGM)是非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)的一種，生長速度較快，在羅氏或7H10培養(yǎng)基上一周內(nèi)可見菌落生長。近年來，全球RGM感染的發(fā)病率在不斷增加[1-2]，但是根據(jù)臨床癥狀或影像學(xué)特征，通常很難區(qū)分RGM感染和結(jié)核分枝桿菌感染[3]；膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌是最常見的致病RGM。膿腫分枝桿菌是最常見的引起NTM肺病的菌種，約50%的NTM肺病由其引起，臨床癥狀與肺結(jié)核相似，難以鑒別。此外，膿腫分枝桿菌也常引起皮膚軟組織和骨關(guān)節(jié)感染。偶發(fā)分枝桿菌與膿腫分枝桿菌類似，既可引起肺病，也可引起皮膚軟組織和骨關(guān)節(jié)感染[4]。而龜分枝桿菌主要引起人類的皮膚、骨骼和軟組織感染，極少引起肺部感染。近年來，龜分枝桿菌感染也成為外科手術(shù)和醫(yī)學(xué)美容手術(shù)常見的伴發(fā)感染，如器官移植、整容手術(shù)、美容注射吸脂手術(shù)及紋身等[5-6]。

由RGM感染引起疾病的治療仍然十分困難，因其對多種一線抗結(jié)核藥物天然耐藥[7]。因此，準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)對RGM感染致病的臨床治療至關(guān)重要。在中國，疑似結(jié)核病患者中NTM感染的占比約為6.3%，最常見的RGM感染菌種分別是膿腫分枝桿菌(20.3%)、龜分枝桿菌(10.5%)和偶發(fā)分枝桿菌(6.4%)[8]。為此，筆者擬對上述3種我國最常見的RGM臨床分離株和RGM標(biāo)準(zhǔn)株采用Sensititre RAPMYCO藥敏板測定其對13種抗生素的敏感性，以了解其抗生素耐藥特征譜，從而為RGM感染的個體化治療提供重要依據(jù)。

材料和方法

1.菌株選擇：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2015年1月至2019年12月從臨床樣本中分離出的98株RGM，包括25株偶發(fā)分枝桿菌、70株膿腫分枝桿菌和3株龜分枝桿菌。這些臨床分離株的患者來源于中國的北方，包括13個省份及北京和天津兩個直轄市。選取在對硝基苯甲酸(500 μg/ml)生長試驗陽性的菌株，進(jìn)行hsp65、rpoB和16S rRNA、16-23S rRNA基因的測序，將所有臨床分離株鑒定至菌種水平。龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標(biāo)準(zhǔn)株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(American Type Culture Collection，ATCC)。

2.試劑儀器：藥敏試驗使用Sensititre RAPMYCO 藥敏板(美國賽默飛公司)進(jìn)行檢測，其可在不需要儀器設(shè)備的情況下定量評估臨床分離株對13種抗生素的藥物敏感性[7]。該板是含有凍干抗生素的微孔板，用于檢測RGM菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[9]。該板含有以下濃度的13種抗生素：阿米卡星，1～64 μg/ml；妥布霉素，1～16 μg/ml；阿莫西林-克拉維酸，2/1 μg/ml～64/32 μg/ml；頭孢西丁，4～128 μg/ml；亞胺培南，2～64 μg/ml；環(huán)丙沙星，0.12～4 μg/ml；莫西沙星，0.25～8 μg/ml；克拉霉素，0.03～16 μg/ml；利奈唑胺，1～32 μg/ml；米諾環(huán)素，1～8 μg/ml；多西霉素，2～64 μg/ml；替加環(huán)素，0.015～4 μg/ml；甲氧芐啶-磺胺甲噁唑，0.25/4.75 μg/ml～8/152 μg/ml。

3.MIC測定：在無菌生理鹽水中制備菌懸液，將其比濁至0.5 麥?zhǔn)蠞舛取?0 μl的菌懸液加入10 ml的Mueller Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基，最終接種液細(xì)菌載量為1×105～5×105CFU/ml。顛倒混勻后向每孔加入100 μl菌懸液。將100 μl菌懸液轉(zhuǎn)移到含有13種抗生素的平板的各個孔中。用黏性密封紙密封接種板，并在28～30 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h。如果在對照孔中有菌生長，表現(xiàn)為渾濁或孔底部有沉積物，表示菌量已足夠，記錄各含藥孔的細(xì)菌生長情況，第一個抑制細(xì)菌生長的藥物濃度，即為MIC值。否則，繼續(xù)培養(yǎng)48 h再判讀結(jié)果。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：對實驗菌株的耐藥情況進(jìn)行描述性分析。

結(jié) 果

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株的耐藥情況：龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標(biāo)準(zhǔn)株在不同批次實驗中MIC值顯示出高度的可重復(fù)性，見表1。

表1 13種抗生素對3種快生長分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度(μg/ml)

2.龜分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：除有1株龜分枝桿菌臨床分離株的MIC>64 μg/ml表現(xiàn)為對阿米卡星耐藥外，阿米卡星對其余2株龜分枝桿菌的抑菌活性均較好。對于納入的3株龜分枝桿菌臨床分離株，替加環(huán)素對其MIC分別為0.12、1、2 μg/ml。但莫西沙星、環(huán)丙沙星和利奈唑胺對龜分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。

3.偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：阿米卡星對偶發(fā)分枝桿菌的抑菌活性最佳，敏感率為100.0%(25/25)。替加環(huán)素也對其表現(xiàn)出優(yōu)越的抗菌活性，敏感率可達(dá)100.0%(25/25)。對于氟喹諾酮類藥物，莫西沙星和環(huán)丙沙星均表現(xiàn)出對偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株高度的體外抑菌活性。但只有4.0%(1/25)納入的偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素敏感(表2)。

表2 偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

4.膿腫分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：阿米卡星對膿腫分枝桿菌的抑菌活性最佳，敏感率為90.0%(63/70)；替加環(huán)素也對其表現(xiàn)出優(yōu)越的抑菌活性，敏感率可達(dá)到72.9%(51/70)。此外，大多數(shù)膿腫分枝桿菌對克拉霉素敏感或中介敏感。但莫西沙星和環(huán)丙沙星對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。幾乎所有納入的膿腫分枝桿菌臨床分離株均對利奈唑胺耐藥(表3)。

表3 膿腫分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結(jié)果

5.不同藥品對3種RGM耐藥情況比較：阿米卡星對3種RGM均具有很好的體外抑菌效果，對偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和90.0%(63/70)；3株龜分枝桿菌臨床分離株中，有2株對阿米卡星敏感。替加環(huán)素對RGM的體外抑菌效果更好，對偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和72.9%(51/70)。莫西沙星和環(huán)丙沙星對偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株表現(xiàn)出較強的抑菌活性，敏感率分別為100.0%(25/25)和92.0%(23/25)，而對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有體外抑菌活性，耐藥率均為95.7%(67/70)。幾乎所有檢測的RGM臨床分離株均對頭孢西丁、多西環(huán)素、利奈唑胺、亞胺培南和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑耐藥。

討 論

美國胸科協(xié)會對于RGM(龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌)的推薦治療方案是依據(jù)體外藥敏試驗的結(jié)果選擇藥物。對于偶發(fā)分枝桿菌引起的肺病，推薦使用至少2種以上體外敏感的藥物進(jìn)行治療，直至痰菌陰轉(zhuǎn)12個月；對于膿腫分枝桿菌肺病，推薦使用含克拉霉素的多藥物治療方案[4]。實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦對RGM(包括膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌和Fuerth分枝桿菌)應(yīng)進(jìn)行以下藥品的藥敏試驗，包括阿米卡星、頭孢西丁、克拉環(huán)素、阿奇霉素、亞胺培南、莫西沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、美羅培南等[10]。本研究所用的RAPMYCO MIC 藥敏板涵蓋了實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦對RGM藥敏試驗的全部抗生素，其藥敏試驗結(jié)果可為RGM感染的治療提供重要依據(jù)。

研究顯示，阿米卡星對膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌的抑菌活性強，而妥布霉素僅對龜分枝桿菌有效，這與其他研究結(jié)果一致[7,11]。與多西霉素/米諾環(huán)素相比，替加環(huán)素在先前的研究及本研究中均對RGM表現(xiàn)出較低的MIC，目前被認(rèn)為是一種有前景的藥品[11]。筆者研究數(shù)據(jù)顯示，幾乎所有納入的臨床分離株均對頭孢西丁、多西環(huán)素和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑具有抗性，這與Cavusoglu等[9]研究一致。對于亞胺培南，所有納入的RGM分離株均對其耐藥，這也與先前的研究一致，即偶發(fā)分枝桿菌對亞胺培南的敏感率每年都以9.5%的速度下降[12]。本研究中，納入的膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率僅為2.9%，與Hatakeyama等[13]的研究結(jié)果不一致，其報告了膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率為76.9%(10/13)。陳品儒等[14]發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)分離的膿腫分枝桿菌耐藥率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，2010年的敏感率為87.1%(27/31)，而2011年則降為68%(17/25)。隨著利奈唑胺在我國臨床上的廣泛應(yīng)用，勢必導(dǎo)致耐藥菌株的數(shù)量不斷增加。

本研究采用商品化的RAPMYCO MIC 藥敏板檢測RGM的藥物敏感性，該方法已經(jīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用于臨床診斷。與傳統(tǒng)的羅氏藥敏試驗相比，RAPMYCO MIC藥敏板無需手工制備不同藥物濃度的培養(yǎng)基，操作簡單；與MGIT 960液體藥敏試驗相比，RAPMYCO MIC藥敏板法成本低、檢測藥物種類更多且可以報告MIC，可以更好地指導(dǎo)臨床用藥。因此，RAPMYCO MIC藥敏板是一種快速、簡單且經(jīng)濟(jì)的藥敏試驗檢測方法。

綜上所述，阿米卡星、替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、莫西沙星和克拉霉素對RGM表現(xiàn)出良好的抑菌活性，此結(jié)果可為RGM感染的治療提供參考。目前，RGM感染治療可供選擇的藥物仍非常有限，需要對RGM感染治療方案的優(yōu)化提供更多的數(shù)據(jù)。RAPMYCO MIC藥敏板操作簡單，可以方便、快速地檢測出RGM對13種抗生素的敏感性，適合在臨床上常規(guī)開展使用。