基于16S rRNA V4區(qū)高通量測(cè)序的初治菌陽肺結(jié)核患者腸道菌群構(gòu)成與表型分析

易一行 喻容 石國(guó)民 馬小華 肖四方 稅劍 范任華 向延根

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的慢性傳染性疾病，人類以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染最常見。MTB感染機(jī)體后，因其專性需氧的特性，通常以肺部感染最常見，即引起“肺結(jié)核”。 MTB是單一病原體感染致死的主要原因之一，對(duì)人類健康與公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅[1]，因此，采取有效的預(yù)防措施，減少宿主對(duì)MTB的易感性，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和控制具有重要意義。

“肺-腸軸”理論的提出，揭示了腸道菌群與肺部疾病的發(fā)展有關(guān)[2]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了腸道菌群與肺結(jié)核之間的相關(guān)性，Winglee等[3]發(fā)現(xiàn)MTB感染會(huì)使小鼠腸道菌群種類與豐富度顯著降低。宿主腸道菌群失調(diào)后，肺樹突狀細(xì)胞C型凝集素受體的表達(dá)下調(diào)，降低了CD4+T細(xì)胞的活化水平，進(jìn)而增強(qiáng)了宿主對(duì)MTB的易感性[4]。獼猴的基線腸道菌群狀況與MTB感染后的病情嚴(yán)重程度相關(guān)[5]，給腸道菌群失調(diào)的小鼠進(jìn)行糞便移植或者補(bǔ)充植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)能夠恢復(fù)小鼠的抗MTB免疫力[4]，這表明宿主腸道菌群失調(diào)可能會(huì)影響人類MTB感染后的疾病進(jìn)展，以及導(dǎo)致宿主對(duì)MTB的易感性，但目前與之相關(guān)的臨床研究少有報(bào)道。

高通量測(cè)序技術(shù)加速了人類對(duì)腸道微生態(tài)的理解，分析宿主在健康和患病狀態(tài)時(shí)腸道菌群的組成，可以識(shí)別與疾病有關(guān)的腸道菌群改變，為疾病的預(yù)防和治療提供新的干預(yù)措施。筆者基于臨床研究收集29例肺結(jié)核患者與28名健康對(duì)照者的糞便進(jìn)行高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析，對(duì)兩組樣本腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)、細(xì)菌表型之間的差異進(jìn)行分析，以期為結(jié)核病的治療與預(yù)防提供新的方向。

材料和方法

一、 材料收集

1.研究對(duì)象：采集2020年4月14日至12月28日就診于南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院29名確診為初治菌陽肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)的糞便標(biāo)本。采集同期在本院進(jìn)行健康體檢的28名志愿者(對(duì)照組)糞便標(biāo)本。志愿者年齡、性別、居住地與納入患者匹配。兩組研究對(duì)象的一般資料見表1。

表1 一般資料在肺結(jié)核組和對(duì)照組中的分布情況

2.肺結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～60歲；(2)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)為《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[6]，經(jīng)利福平耐藥基因檢測(cè)、分枝桿菌快速培養(yǎng)、MTB核酸檢測(cè)鑒定為MTB病原學(xué)陽性，結(jié)合胸部CT檢查確定為肺結(jié)核患者；(3)既往無抗結(jié)核治療史；(4)3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素與益生菌產(chǎn)品；(6)同意入組，簽署知情同意書。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～60歲；(2)體檢結(jié)果提示身體健康且無胃腸道疾病史；(3)3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素與益生菌產(chǎn)品；(4)同意入組，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦或備孕者；(2)精神障礙患者；(3)嚴(yán)重心、肝、腎等疾病患者；(4)使用免疫抑制劑患者；(5)3個(gè)月內(nèi)參加其他藥物臨床實(shí)驗(yàn)患者。倫理學(xué)審核：該項(xiàng)目通過南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：R201956。

二、 研究方法

1. 糞便標(biāo)本采集：使用無菌棉簽，于清晨采集對(duì)照組與肺結(jié)核組新鮮糞便1～2 g置于細(xì)菌DNA保存液中，并立即轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱保存待檢。

2．糞便標(biāo)本DNA提取與PCR擴(kuò)增：使用PowerMax DNA(MoBio實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州設(shè)備制備，批號(hào)：20190952)分離試劑盒從糞便樣本中提取細(xì)菌全基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定所提取的細(xì)菌總DNA完整性后，使用NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)對(duì)所提取DNA進(jìn)行定量，將細(xì)菌總DNA主帶完整無污染的樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。使用PCR擴(kuò)增引物 (正向引物515F: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，反向引物806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對(duì)細(xì)菌總DNA中16S rRNA gene V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增建庫。采用Agencourt AMPure XP 60 ml Kit核酸純化試劑盒(美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司)與Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)生命技術(shù)公司)對(duì)PCR進(jìn)行純化與量化。依據(jù)靶標(biāo)序列和引物序列獲得原始資料中單個(gè)樣本數(shù)據(jù)，去除靶標(biāo)及引物序列后使用Vsearch(v2.4.4)對(duì)每份樣本的堿基序列進(jìn)行拼接，得到原始?jí)A基序列。同時(shí)對(duì)原始?jí)A基序列進(jìn)行質(zhì)量控制與過濾，去除低質(zhì)量序列的標(biāo)準(zhǔn)為：序列<150 bp，平均質(zhì)量低于20 bp，含有不明堿基序列，存在>80 bp的單核苷酸重復(fù)序列，去除嵌合體后最終獲得有效數(shù)據(jù)。Illumina Novaseq 6000平臺(tái)對(duì)純化后的細(xì)菌16S rRNA gene V4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

3. 生物信息學(xué)分析：基于Sliva128 數(shù)據(jù)庫，通過Vsearch對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋，獲得操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)物種信息，測(cè)序數(shù)據(jù)分析主要使用R軟件包(v3.2.0)和QIIME軟件。QIIME軟件計(jì)算OTU水平α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)，及門、屬水平的相對(duì)豐度，并生成OTU 水平豐度等級(jí)曲線(ranked abundance)。R軟件包 “VennDiagram” 生成韋恩圖。R語言ggplot 繪制屬水平氣泡圖。BugBase細(xì)菌表型預(yù)測(cè)工具，獲取微生物的7類表型信息，比較門水平下不同表型的細(xì)菌在各組的組成。

注 a.折線越長(zhǎng)表明樣本OTU數(shù)目越多，曲線越平緩表明群落的均勻度越高；b.韋恩圖，反映兩組間共有與特有的OTU數(shù)目圖1 豐度等級(jí)曲線與韋恩圖

注 紅色為對(duì)照組，藍(lán)色為肺結(jié)核組，每一個(gè)圓點(diǎn)代表一份樣本，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離大小代表了樣本之間的相似性圖2 β多樣性分析

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 OTU聚類與統(tǒng)計(jì)

57份糞便標(biāo)本細(xì)菌16S rRNA gene V4可變區(qū)擴(kuò)增測(cè)序，總共獲得7 432 960條有效序列 (clean reads)，人均130 403條Clean reads。測(cè)序平均覆蓋度為(94.51±0.15) %，足以說明樣本所涵蓋的腸道菌群類別。以≥97%的相似序列聚類為1個(gè)操作分類單位，表征物種的豐富程度和均勻程度的OTU 豐度等級(jí)曲線與兩組間OTU韋恩圖共享情況見圖1。

二、肺結(jié)核患者腸道菌群多樣性分析

β多樣性利用主坐標(biāo)分析(principal，PcoA)的降維分析方法，將所有樣本置于差異可視化的二維坐標(biāo)系中，這種非限制性排序，以樣本的相似性距離為基礎(chǔ)分析，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離遠(yuǎn)近代表樣本之間的差異大小，基于加權(quán)距離(weighted unifrac based PcoA)與非加權(quán)距離(unweighted unifrac based PcoA)觀察到兩組樣本各自聚類，PERMANOVA算法(R2=0.253，P=0.001)表明肺結(jié)核組與對(duì)照組腸道菌群構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。α多樣性指數(shù)是用以描述組間腸道菌群種類(多樣性)與數(shù)目(豐富度)的指標(biāo)，其中香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)反映群落的多樣性，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映群落的豐富度。對(duì)照組與肺結(jié)核組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 α多樣性指數(shù)在肺結(jié)核組與對(duì)照組中的比較

三、肺結(jié)核患者腸道菌群門水平構(gòu)成分析

共檢測(cè)出17種菌門，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、TM7、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)為隊(duì)列中豐度前10位的菌門。擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)照組中總占比為98.50%，肺結(jié)核組中為93.05%。擬桿菌門對(duì)照組中占比為42.74%，肺結(jié)核組中為44.84%;厚壁菌門對(duì)照組中占比為51.55%，肺結(jié)核組中為35.44%；變形菌門對(duì)照組中占比為4.21%，肺結(jié)核組中為12.77%，見圖3。其中，肺結(jié)核組腸道菌群中厚壁菌門(35.44%)明顯低于對(duì)照組(51.55%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.290，P<0.01)。

圖3 門水平組間菌群構(gòu)成差異分析

四、肺結(jié)核患者腸道菌群屬水平構(gòu)成分析

共檢測(cè)到253種菌屬，其中肺結(jié)核組與對(duì)照組差異菌屬共12種，分別為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、臭桿菌屬(Odoribacter)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、Anaerostipes、勞特氏菌屬(Blautia)、糞球菌屬(Coprococcus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、羅氏菌屬(Roseburia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、真桿菌屬(Eubacterium)，見表3。

表3 腸道菌群屬水平相對(duì)豐度在肺結(jié)核組與對(duì)照組的比較

五、基于BugBase表型分類的腸道菌群功能預(yù)測(cè)

與對(duì)照組比較，肺結(jié)核組患者腸道中厭氧菌(Anaerobic)基因相對(duì)豐度與革蘭氏陽性菌(Gram-positive)基因相對(duì)豐度均降低，兼性菌(Facultatively anaerobic)基因相對(duì)豐度與革蘭氏陰性菌(Gram-negative)基因相對(duì)豐度均增高，生物膜形成能力(Forms biofilms)的細(xì)菌基因相對(duì)豐度增高，腸道菌群氧化脅迫(stress tolerant)耐受能力增強(qiáng)。此外，需氧菌(Aerobic)基因相對(duì)豐度與具有移動(dòng)組件(Contains mobile elements)的細(xì)菌基因相對(duì)豐度升高，具有潛在致病性(Potentially pathogenic)細(xì)菌的基因相對(duì)豐度增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 腸道菌群表型相對(duì)豐度百分比在肺結(jié)核組與對(duì)照組的比較

討 論

結(jié)核病作為一種慢性消耗性疾病，其疾病的預(yù)后與人體自身的營(yíng)養(yǎng)免疫狀況密切相關(guān)，腸道作為人體最大的黏膜系統(tǒng)，富含豐富的腸道菌群，腸道菌群通過黏膜免疫系統(tǒng)，以及分泌代謝產(chǎn)物由血液循環(huán)到達(dá)全身各處，參與宿主的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)，對(duì)宿主健康至關(guān)重要[7]。筆者應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析對(duì)肺結(jié)核患者腸道菌群總體組成與細(xì)菌表型進(jìn)行分析。腸道菌群多樣性研究結(jié)果表明，肺結(jié)核患者腸道菌群與健康對(duì)照者相比α多樣性下降，β多樣性存在明顯差異，這表明在肺結(jié)核感染的病理狀態(tài)下，患者出現(xiàn)明顯的菌群種類與豐度下降或者定植困難，其原因可能與病原體感染激活全身免疫系統(tǒng)，機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而引起菌群種類與豐度下降有關(guān)[8]。

腸道菌群構(gòu)成分析顯示，擬桿菌門與厚壁菌門為兩組的優(yōu)勢(shì)菌門，占總菌門數(shù)的85%以上，其次為變形菌門、梭桿菌門與放線菌門。其中，兩組間差異菌門為厚壁菌門，肺結(jié)核患者腸道內(nèi)厚壁菌門豐度明顯低于健康對(duì)照組，這與Wu等[9]對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本菌群變化的研究結(jié)論一致。厚壁菌門是人類腸道菌群中豐度最高的菌門，占腸道菌群的20.5%～80%，大部分腸道短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)產(chǎn)生菌與益生菌均屬于厚壁菌門[10]。此外，健康人的腸道菌群厚壁菌門比例通常較高[11]。研究表明，若疾病狀態(tài)下機(jī)體腸道內(nèi)厚壁菌門比例降低，則會(huì)引起胃腸道代謝異常，并導(dǎo)致血液循環(huán)系統(tǒng)中SCFAs的濃度降低，進(jìn)而影響宿主免疫系統(tǒng)和全身炎癥因子的組成[12]。肺結(jié)核患者腸道菌群厚壁菌門豐度降低提示肺結(jié)核患者腸道菌群紊亂，可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損[10]。

兩組間差異菌屬共鑒定出12種，其中雙歧桿菌屬屬于放線菌門，副擬桿菌屬與臭桿菌屬屬于擬桿菌門，梭狀芽胞桿菌屬、Anaerostipes、勞特氏菌屬、糞球菌屬、毛螺菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬、真桿菌屬均屬于厚壁菌門。雙歧桿菌是一種益生菌，研究表明雙歧桿菌在小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染中具有促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗體和γ-干擾素(INF-γ)，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性的有益作用[13]，除了對(duì)抗細(xì)菌感染，雙歧桿菌還可以通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生減輕哮喘小鼠模型的肺部病理改變[14]，這表明肺結(jié)核患者腸道雙歧桿菌下降，可能不利于疾病的預(yù)后。差異菌屬中SCFAs產(chǎn)生菌包括：梭狀芽胞桿菌屬[15]、毛螺菌屬[16]、羅氏菌屬[16]、瘤胃球菌屬[16]、真桿菌屬[16]、糞桿菌屬[16]、勞特氏菌屬[17]、糞球菌屬[17]、Anaerostipes[18]，其中只有Anaerostipes、真桿菌屬在肺結(jié)核組呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其余菌屬均較健康對(duì)照組下降，因羅氏菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬為人體腸道內(nèi)主要的SCFAs產(chǎn)生菌[19]，推測(cè)肺結(jié)核組腸道內(nèi)SCFAs產(chǎn)生下降。文獻(xiàn)報(bào)道，SCFAs至少通過兩種機(jī)制作用于免疫和內(nèi)皮細(xì)胞：激活G蛋白偶聯(lián)受體和抑制組蛋白去乙?；?，其與各種類型的免疫細(xì)胞功能及宿主的免疫應(yīng)答相關(guān)[20]，并可抑制腸道病原體定植，維持腸上皮屏障完整及為腸細(xì)胞提供能量[21-22]。在炎癥性腸病、結(jié)直腸癌和糖尿病等炎癥相關(guān)疾病患者的腸道菌群中也觀察到SCFAs產(chǎn)生菌豐度的降低[23]。結(jié)核病患者SCFA產(chǎn)生菌的下降可能表明全身炎癥加劇和全身免疫反應(yīng)受損，從而對(duì)肺結(jié)核患者產(chǎn)生不利影響。然而，Segal等[24]發(fā)現(xiàn)，艾滋病患者口腔以及肺部的厭氧菌通過發(fā)酵SCFAs，從而誘導(dǎo)HIV感染患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分化，以及抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ和IL-17A的產(chǎn)生，增加HIV感染患者對(duì)MTB的易感性。同樣，Lachmandas等[25]在肺結(jié)核與糖尿病共病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽可降低MTB誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子反應(yīng)，同時(shí)增加IL-10的產(chǎn)生，增加宿主感染結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，SCFAs可能在肺結(jié)核與其他疾病共病患者體內(nèi)發(fā)揮不利作用，SCFAs產(chǎn)生菌在肺結(jié)核患者，以及在肺結(jié)核與其他疾病共病患者體內(nèi)的具體作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

BugBase是一種微生物表型預(yù)測(cè)工具，基于OTU物種信息可對(duì)人類腸道菌群的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，本研究中BugBase分析結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者腸道菌群生物膜形成能力增強(qiáng)、革蘭氏陰性菌比例增加、氧化脅迫耐受，綜合兩組的氧需求(需氧菌、厭氧菌、兼性菌)表型來看，肺結(jié)核患者腸道菌群厭氧菌減少，兼性菌增加，提示肺結(jié)核組患者腸道菌群氧耐受能力明顯提高，該能力的提高預(yù)示肺結(jié)核組患者腸道菌群處于紊亂狀態(tài)[26]。正常情況下，腸道是一個(gè)高強(qiáng)度的厭氧環(huán)境，腸道微生物主要由厭氧菌組成，當(dāng)腸道理化環(huán)境，如pH值、離子濃度、水分、腸道通透性等的改變會(huì)引起腸道氧氣增多，而人體腸道內(nèi)的條件致病菌氧耐受程度遠(yuǎn)大于腸道正常菌群[27]，氧動(dòng)力學(xué)在調(diào)節(jié)腸道動(dòng)態(tài)平衡中起著核心作用，氧梯度的破壞是引起許多腸道疾病的原因，包括炎癥性腸病和大腸癌等[28]。肺結(jié)核患者腸道菌群中需氧菌及兼性厭氧菌豐度增高，提示肺結(jié)核患者的腸道微生態(tài)環(huán)境中氧含量的增加，這種改變可能是肺結(jié)核患者感染MTB的因素之一。

本研究存在一定的局限性，僅初步發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者腸道菌群組成及表型與健康對(duì)照者存在區(qū)別，尚不能確定這種變化的發(fā)生是在MTB感染之前還是之后，后續(xù)仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的因果關(guān)系。并且受試者未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飲食，而飲食對(duì)個(gè)體腸道菌群具有一定的影響[29]。同時(shí)，由于不是16S全長(zhǎng)測(cè)序，16S rRNA V4對(duì)菌群的分辨率較低，無法鑒定到種水平，且16S是存在于所有細(xì)菌中的一段序列[30]，無法鑒定腸道微生物中寄生蟲、病毒、真菌，選擇宏基因組測(cè)序可以對(duì)樣本中所有微生物進(jìn)行鑒定。但細(xì)菌16S序列具有高度的相似性，對(duì)16S rRNA V4區(qū)測(cè)序，可以將腸道菌群鑒定到屬水平[31]，且其測(cè)序成本遠(yuǎn)低于宏基因測(cè)序，目前仍廣泛應(yīng)用于鑒定疾病狀態(tài)下患者與健康對(duì)照者腸道菌群的差異性研究中。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在疾病狀態(tài)下，肺結(jié)核患者存在腸道菌群組成及細(xì)菌表型改變，肺結(jié)核患者腸道菌群多樣性下降，菌群定植能力低于健康人。菌群組成水平上SCFAs產(chǎn)生菌相關(guān)的細(xì)菌豐度下降，目前已有研究證明補(bǔ)充益生菌能增強(qiáng)宿主的抗結(jié)核免疫力[4]。本研究為探索微生態(tài)療法在肺結(jié)核疾病中的治療提供了一定的研究思路。