UPLC-MS/MS 法同時(shí)測定三黃片中5 種成分的含量

岳磊，張丹，黃麗杰，李曉靜

1.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

作為一種臨床常用的中成藥，三黃片是從東漢張仲景《金匱要略》中“三黃瀉心湯”的方劑中衍生而出的，最初的方劑配伍是由大黃、黃芩、黃連三味藥材組成。歷經(jīng)各版藥典收載，在《中國藥典》2015年版制法中規(guī)定，由大黃、鹽酸小檗堿和黃芩浸膏三味處方組成，具有清熱解毒，泄火通便的功能［1］。檢測標(biāo)準(zhǔn)使用HPLC 法，以三套不同的液相條件，分別針對大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿及黃芩苷分別進(jìn)行含量測定，其流程繁瑣，耗時(shí)較長［2］。其他分析方法還有薄層色譜法、紫外合并紅外光譜法，HPLC 法、UPLC 法及UPLC-QTOF/MS 法。除此之外，也有使用主成分分析法針對分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的研究［3-9］。近年來在中藥分析領(lǐng)域，UPLC-MS/MS 法得到了更多的應(yīng)用［10-11］。質(zhì)譜檢測法在測定多種成分的時(shí)，對被測成分在液相條件下的分離度沒有強(qiáng)制要求，響應(yīng)更加靈敏的同時(shí)更具有針對性。通過對三黃片中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿的液相條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，使之成為一種更加便捷的測定方法，可以在日常工作中幫助檢驗(yàn)檢測人員有效地提高檢驗(yàn)工作時(shí)的工作效率和準(zhǔn)確程度，為更全面地針對不同廠家，不同批次的三黃片進(jìn)行質(zhì)量控制提供更好的技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀，型號：ACQUITY UPLC（美國Waters）；線型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號：4000 QTrap（美國Sciex）；電子分析天平，型號：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超聲波清洗機(jī)，型號：SB-800DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

對照品分別為：大黃素（110756-201512，98.7%）、大黃酚（110796-201922，99.4%）、大黃素甲醚（110758-201817，99.2%）、黃芩苷（110715-201619，93.5%）、鹽酸小檗堿（110713-201814，86.7%），均為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；三黃片為河南省及鄭州市2018-2020年度安全監(jiān)督抽檢樣品；乙腈、甲醇（德國Merck）；甲酸（美國Fisher）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：CORTECS UPLC C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫程序（0～3 min，20%→90%A；3～4 min，90%A ；4～4.1 min，90% →20%A ；4.1～5 min，20%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。ESI 離子源；正、負(fù)離子實(shí)時(shí)切換掃描；多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。大黃素等5 個(gè)成分的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 混合對照品溶液制備

分別稱取5 種對照品（大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿）約10 mg（精確至0.01 mg），置于100 mL 容量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別使用移液器量取適量體積，置于10 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成混合對照品溶液，對應(yīng)各濃度分別為1.051 2 μg/mL、1.037 5 μg/mL、1.057 0 μg/mL、19.753 6 μg/mL、5.205 0 μg/mL。

2.3 供試品溶液制備

分別取不同批次三黃片各10 片，糖衣片除去包衣后研細(xì)（薄膜衣片直接研細(xì)），取約0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 錐形瓶，加入70% 甲醇50 mL，稱重（精確至0.000 1 g）。滿功率超聲30 min，取出后放至室溫，再次稱重，如出現(xiàn)重量損失的情況，添加70%甲醇直至重量與超聲前一致，搖勻后使用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

取《中國藥典》三黃片制法項(xiàng)下除去主藥外的空白藥用輔料約0.1 g（精確至0.000 1 g），按“2.3”項(xiàng)下的方法制得陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別取稀釋后的混合對照品溶液（精密量取混合對照品溶液5 mL，置于50 mL 容量瓶，加適量甲醇稀釋至刻度），供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：5種目標(biāo)化合物在供試品及稀釋后的混合對照品溶液的選擇離子流圖（XIC）中在相同時(shí)間均有出峰，而陰性對照溶液XIC 圖中對應(yīng)時(shí)間均無信號干擾，專屬性強(qiáng)。

圖1 5種成分的提取離子流圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液

2.6 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、50.00 mL（精確至0.01 mL），分別置于100 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸方程計(jì)算，各成分在對應(yīng)范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見表2。

表2 線性關(guān)系、檢測限和定量限

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)下的稀釋后的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果顯示，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿峰面積的RSD 分別為4.24%、4.45%、3.74%、2.13%、2.17%，表明儀器的精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取同一批號的三黃片細(xì)粉（批號為1812010）6 份，平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定。測得各成分的平均含量分別為1.377 mg/片、0.373 mg/ 片、0.762 mg/ 片、16.361 mg/ 片、4.357 mg/ 片，其RSD 分別為3.89%、4.18%、4.76%、2.32%、2.18%，表明本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)選取“2.8”項(xiàng)下任意一份平行樣，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h 后測定。結(jié)果各成分的RSD 分別為4.27%、4.85%、4.61%、2.03%、2.68%，表明該供試品溶液樣品在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

稱取6 份“2.8”項(xiàng)下細(xì)粉各約0.05 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 錐形瓶，再精密加入混合對照品溶液適量，按照“2.3”項(xiàng)下步驟制備6 份加標(biāo)供試品溶液，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為87.65%、90.36%、84.21%、95.83%、92.73%，其RSD 分別為2.54%、2.75%、3.31%、2.57%、2.41% 。

2.11 供試品含量測定

取10批三黃片樣品（規(guī)格均為小片，其中9批糖衣片，1批薄膜衣片），按照“2.3”項(xiàng)下步驟制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，通過“2.6”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果（mg/片）

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

相較于其他中成藥，三黃片的處方較為特殊，從制法上看，鹽酸小檗堿作為單一成分入藥，黃芩以浸膏形式入藥，且兩者用量相對較少，直接針對鹽酸小檗堿及黃芩苷進(jìn)行含量測定。而大黃則是一半以浸膏形式入藥而另一半直接制成細(xì)粉入藥，且用量較大，藥典方法以大黃素和大黃酚含量之和作為綜合考量，而本文中增加了大黃素甲醚作為含量測定對象，使用液質(zhì)聯(lián)用方法，一次性針對其中的目標(biāo)成分進(jìn)行檢測，從而對其進(jìn)行更為全面的質(zhì)量控制研究。

3.2 提取方法的優(yōu)化

針對供試品前處理中的提取方式、選用溶劑與提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化研究。其中提取方式選擇了直接超聲和回流提取，結(jié)果顯示二者提取率差異較小，而超聲提取操作較為便捷。選擇的溶劑包括甲醇、50%甲醇、70%甲醇與90%甲醇，最終選用提取率較高的70%甲醇。超聲提取時(shí)間在15 min、30 min與45 min 之間進(jìn)行對比，結(jié)果表明選用超聲30 min的樣品，其提取率明顯高于15 min，與45 min的樣品相比差別不明顯。經(jīng)綜合考量，最終確定選用提取溶劑為70%甲醇，超聲提取時(shí)間選擇30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的優(yōu)化先采用相同比例的甲醇-水、甲醇-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）進(jìn)行考察。結(jié)果顯示使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，其圖譜的峰型比甲醇的更好，目標(biāo)化合物的分離程度也更好；而對比加入0.1%的甲酸的水相與純水相，可明顯看到加入0.1%的甲酸可以有效增強(qiáng)這5種化合物的信號強(qiáng)度，也能改善峰形的對稱性。最后考察了不同梯度的洗脫方式，進(jìn)一步提升了分離效率。最終選擇乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式進(jìn)行試驗(yàn)。

10批樣品測定結(jié)果中可以看出，由于鹽酸小檗堿以原料藥細(xì)粉入藥，各批次含量結(jié)果差異最?。灰渣S芩苷作為黃芩浸膏原料的特征成分，各個(gè)批次含量結(jié)果差異也相對較??；以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為大黃藥材細(xì)粉及浸膏原料的特征成分來看，呈現(xiàn)出較大差異。其中相同廠家不同批次之間差異較小，不同廠家之間各組分含量及相應(yīng)比例均有較為明顯的差異。