黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠血糖代謝的調(diào)控作用及機(jī)制研究

陳麗莉，劉 月，牛曉琪，劉 威，畢秀麗

黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠血糖代謝的調(diào)控作用及機(jī)制研究

陳麗莉，劉 月，牛曉琪，劉 威，畢秀麗*

遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036

探究黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠血糖代謝的調(diào)控作用及其作用機(jī)制。方法 分別以鏈脲佐菌素和四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠建立糖尿病模型，給予含黑樹(shù)莓多酚的飼料喂養(yǎng)，檢測(cè)各組小鼠血糖；采用試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中三酰甘油（triglyceride，TG）和總膽固醇（cholesterol，CHO）水平；考察黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響；采用qRT-PCR法考察黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠肝臟中白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，）、、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）mRNA和骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，）和AMP激活蛋白激酶α1（AMP-activated protein kinase α1，）mRNA表達(dá)的影響；采用Western blotting法檢測(cè)黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠骨骼肌中胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。黑樹(shù)莓多酚顯著降低鏈脲佐菌素和四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠空腹血糖和糖耐量（＜0.05、0.01），顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中TG和CHO水平（＜0.05），顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟指數(shù)（＜0.05），顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟中、、和mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；顯著上調(diào)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中磷酸化胰島素受體底物（phosphorylated insulin receptor substrate，p-IRS）、胰島素受體（insulin receptor，IR）、磷酸化IR（p-IR）和磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著上調(diào)骨骼肌mRNA表達(dá)水平（＜0.05）；顯著上調(diào)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中p-IRS、IR、p-IR和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）蛋白表達(dá)水平（＜0.05），顯著上調(diào)骨骼肌及mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。黑樹(shù)莓多酚可以通過(guò)激活胰島素信號(hào)通路并促進(jìn)葡萄糖代謝，從而緩解鏈脲佐菌素以及四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中血糖代謝紊亂引發(fā)的相關(guān)癥狀。

黑樹(shù)莓多酚；糖尿病；葡萄糖耐量；血脂；臟器指數(shù)；胰島素信號(hào)通路

糖尿病是一種全球常見(jiàn)的危及生命的代謝性疾病，其特征為由胰島素抵抗或胰島素分泌下降引起的高血糖。糖尿病的發(fā)病率逐年增加，國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)預(yù)計(jì)至2035年將有5.92億人患有糖尿病。因此，尋找有效的方法來(lái)預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥極其重要[1]?，F(xiàn)有的降糖類藥物如胰島素及化學(xué)制劑大多是針對(duì)某一特定類型的病癥進(jìn)行緩解，但可能產(chǎn)生一定的藥物依賴性及不良反應(yīng)[2]。植物活性提取物具有安全、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，作為代替藥物對(duì)于糖尿病的預(yù)防及輔助治療有很大的研究意義。當(dāng)前具有防治糖尿病作用的活性物質(zhì)集中于多酚類、多糖類等化合物，其中多酚類化合物可通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞糖代謝達(dá)到降低血糖的作用[3-4]，參與其中的信號(hào)通路主要有胰島素受體信號(hào)通路、AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路等[5]。

黑樹(shù)莓H. Lévl.又名覆盆子、懸鉤子等，為薔薇科勾懸子屬漿果，黑樹(shù)莓中含有酚酸類、黃酮類、原花青素、鞣質(zhì)、苯乙烯、木脂素、三萜和甾醇等大量多酚類活性物質(zhì)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黑樹(shù)莓花青素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（secreted frizzled-related protein 2，SFRP2）去甲基化[7]，還能夠通過(guò)調(diào)控miR-24-1-5p、miR-483-3p/Dickkopf相關(guān)蛋白3（Dickkopf-related protein 3，DKK3）相關(guān)信號(hào)通路，從而預(yù)防結(jié)直腸癌[8-9]。在飲食誘導(dǎo)的肥胖嚙齒動(dòng)物模型中，含有黑樹(shù)莓花青素的膳食補(bǔ)充劑不會(huì)減緩肥胖的發(fā)展[10]；此外，關(guān)于黑樹(shù)莓花青素對(duì)代謝綜合征患者的血脂譜和血管內(nèi)皮功能的最新研究，揭示了黑樹(shù)莓多酚在血脂代謝相關(guān)疾病中的潛在用途[11]。但黑樹(shù)莓活性成分尚未見(jiàn)血糖調(diào)控相關(guān)研究。本課題組前期研究表明，黑樹(shù)莓提取物對(duì)體外α-糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）活性有很好的抑制作用，表現(xiàn)出潛在的降血糖活性[12]，提示黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病可能具有調(diào)控作用?！侗静萃ㄐ分杏小案才枳樱势饺肽I”之說(shuō)；而中醫(yī)在糖尿病尤其并發(fā)癥的相關(guān)研究中，也一直認(rèn)為其與腎息息相關(guān)。本研究考察了黑樹(shù)莓多酚對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）或四氧嘧啶（allxan，AXN）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的作用及其機(jī)制，為黑樹(shù)莓治療糖尿病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，4周齡，體質(zhì)量20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）-2014-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)保持12 h明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循遼寧大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，符合3R原則。

1.2 黑樹(shù)莓多酚飼料配制

黑樹(shù)莓多酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%）由天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司提供。根據(jù)本課題組前期研究中5%、10%黑樹(shù)莓凍干粉的小鼠喂食劑量，并結(jié)合黑樹(shù)莓多酚的提取率[7,12-13]，將黑樹(shù)莓多酚混合進(jìn)正常飼料中做成日糧，具體成分配比見(jiàn)表1。飼料由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司制作。

1.3 藥品與試劑

STZ（批號(hào)S0130）、AXN（批號(hào)A7413）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；活力型血糖儀及試紙（批號(hào)RSXTSZ）、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；分析級(jí)氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體購(gòu)自北京鼎國(guó)試劑公司；無(wú)RNA酶水（批號(hào)B541018）、RIPA裂解液（批號(hào)C500005）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)C503021）、β-tubulin抗體（批號(hào)D225847）購(gòu)自上海生工生物有限公司；Trizol試劑（批號(hào)CW0580S）、qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)RR047A）購(gòu)自日本Takara公司；胰島素受體（insulin receptor，IR）、磷酸化IR（p-IR）、磷酸化胰島素受體底物（phosphorylated insulin receptor substrate，p-IRS）抗體、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）抗體、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（cholesterol，CHO）試劑盒購(gòu)自北京北華康泰試劑有限公司。

表1 飼料配方

1.4 儀器

7500HT型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Agilent公司）；JY-SCZ2垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；?80 ℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；Cary紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，ip STZ溶液（50 mg/kg），每3天1次，共3次，建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型；ip AXN溶液（50 mg/kg），每3天1次，共3次，建立AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型。小鼠禁食16 h后，于尾端取靜脈血1滴測(cè)其血糖值，選擇血糖值為10～14并出現(xiàn)多飲、多食、多尿狀況的小鼠作為實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型。

2.1.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠分組與給藥 設(shè)置對(duì)照組、模型組以及黑樹(shù)莓多酚低、高劑量組，每組10只。對(duì)照組和模型組每日給予正常飼料喂養(yǎng)，各給藥組給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)8周。

2.1.2 AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠分組與給藥 設(shè)置對(duì)照組、模型組以及黑樹(shù)莓多酚高劑量組，每組10只。對(duì)照組和模型組給予正常飼料，各給藥組給予相應(yīng)飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周。

2.2 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

給藥結(jié)束后，小鼠禁食16 h，檢測(cè)其基礎(chǔ)血糖值，ip葡萄糖溶液（10 μL/g），進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT），于5、15、30、60、120 min測(cè)定血糖值。根據(jù)血糖值繪制曲線，對(duì)藥時(shí)曲線下面積（AUC）積分來(lái)評(píng)價(jià)黑樹(shù)莓多酚對(duì)小鼠機(jī)體糖耐受的改善狀況。

2.3 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠血脂水平的影響

給藥結(jié)束后，采集小鼠眼球后靜脈叢血液1 mL，室溫靜置30 min后，4 ℃、4000 r/min離心15 min，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清中TC和CHO水平。

2.4 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

給藥結(jié)束后，小鼠稱定質(zhì)量，脫頸椎處死，解剖取脾、肝、腎組織，稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量

2.5 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA表達(dá)的影響

取肝臟組織50 mg，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-AGGCAAACCGTGAAAA- GATG-3’，下游引物5’-AGGCAAACCGTGAAAAG- ATG-3’；上游引物5’-GCAACTGTTCCTGAAC- TCAACT-3’，下游引物5’-ATCTTTTGGGGTCCG- TCAACT-3’；上游引物5’-TAGTCCTTCCTAC- CCCAATTTCC-3’，下游引物5’-TTGGTCCTTAGC- CACTCCTTC-3’；上游引物5’-TGAGCAACT- ATTCCAAACCAGC-3’，下游引物5’-GCACGTAG- TCTTCGATCACTATC-3’；上游引物5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，下游引物5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’。

2.6 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠骨骼肌組織p-IRS、IR、p-IR、p-Akt和GSK3β蛋白表達(dá)的影響

骨骼肌組織用液氮磨碎成粉末狀，盡快稱取20 mg磨碎后組織，加入200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解3 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，加入40 μL 5×Loading Buffer混勻后，95 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液，于室溫封閉3 h；分別加入p-IRS、IR、p-IR、p-Akt、GSK3β和β-tubulin抗體，孵育3 h；TBST洗滌3次，30 min/次，加入HRP標(biāo)記的抗小鼠/兔IgG抗體，室溫孵育2.5 h，加入ECL發(fā)光液顯影。

2.7 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠骨骼肌組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）和AMPKα1 mRNA表達(dá)的影響

取骨骼肌組織50 mg，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-CTTGGCTCCCTTCAGT- TTGG-3’，下游引物5’-CTACCCAGCCACGTTGC- ATT-3’；上游引物5’-AAGCCGACCCAAT- GACATCA-3’，下游引物5’-CTTCCTTCGTACACG- CAAAT-3’；上游引物5’-AGGCAAACCGTG- AAAAGATG-3’，下游引物5’-AGGCAAACCGTGA- AAAGATG-3’。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用檢驗(yàn)及方差分析。

3 結(jié)果

3.1 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠一般情況的影響

對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好，毛色有光澤，尿量正常，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作敏捷；造模后第2天，模型組小鼠精神萎靡，扎堆蜷臥，活動(dòng)量減少，被毛凌亂，飲水量和排尿量增加，尤其以AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型更為明顯。各給藥組小鼠的皮毛光澤改善，排尿量減少。

3.2 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

如圖1所示，STZ或AXN誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠血糖水平顯著高于對(duì)照組（＜0.01）；與模型組比較，給予黑樹(shù)莓多酚高劑量飼料第4周開(kāi)始，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖顯著降低（＜0.05、0.01），給予黑樹(shù)莓多酚低劑量飼料第6周開(kāi)始，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖顯著降低（＜0.05）；給予黑樹(shù)莓多酚高劑量飼料第2周開(kāi)始，AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

如圖2所示，STZ或AXN誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠血糖水平及糖耐量曲線AUC積分均顯著高于對(duì)照組（＜0.01）；與模型組比較，給予黑樹(shù)莓多酚低、高劑量飼料15 min時(shí)可抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖的上升狀況，但無(wú)顯著差異；對(duì)糖耐量曲線進(jìn)行AUC積分后，發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓多酚高劑量組顯著抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平（＜0.01）。與STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠不同，黑樹(shù)莓多酚對(duì)AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠表現(xiàn)出了更佳的降血糖效果。黑樹(shù)莓多酚高劑量組將AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖的上升趨勢(shì)延后至30 min；對(duì)糖耐量曲線進(jìn)行AUC積分后，發(fā)現(xiàn)黑樹(shù)莓多酚高劑量組顯著抑制AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平（＜0.05）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

圖2 黑樹(shù)莓多酚對(duì)STZ (A、B)及AXN (C、D) 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠糖耐量的影響()

3.4 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠血脂的影響

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病。如圖3所示，STZ和AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠在體內(nèi)特征上有所不同，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血脂無(wú)顯著變化；AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中TG和CHO水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚高劑量組小鼠血清中TG和CHO水平顯著降低（＜0.05）。

3.5 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

如圖4所示，STZ和AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠在臟器損傷方面也有所不同，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠臟器指數(shù)無(wú)顯著變化；AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟指數(shù)顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚高劑量組小鼠腎臟指數(shù)顯著降低（＜0.05）。

圖3 黑樹(shù)莓多酚對(duì)STZ (A、B)及AXN (C、D) 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血脂的影響()

圖4 黑樹(shù)莓多酚對(duì)STZ (A)及AXN (B) 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響()

3.6 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠肝臟炎癥的影響

糖尿病的高血糖癥狀會(huì)對(duì)機(jī)體的內(nèi)臟造成不同程度的影響，肝臟參與大部分脂代謝，因而在糖尿病糖脂代謝紊亂的條件下，肝臟的負(fù)擔(dān)加重，產(chǎn)生的炎性反應(yīng)作為并發(fā)癥加劇糖尿病的發(fā)展。通過(guò)檢測(cè)肝臟中炎性因子（、、和）轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況，評(píng)估黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠肝臟炎癥的影響。鑒于上述對(duì)糖尿病小鼠并發(fā)癥（血脂水平及臟器指數(shù)）的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，這2項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著變化。因此，選用AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠觀察肝臟炎癥發(fā)生情況。如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中、和表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚高劑量組小鼠肝臟中、、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖5 黑樹(shù)莓多酚對(duì)AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟炎癥的影響()

3.7 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

胰島素影響的葡萄糖代謝大部分由骨骼肌細(xì)胞負(fù)責(zé)，因此骨骼肌在葡萄糖的代謝過(guò)程中起著重要作用。機(jī)體骨骼肌對(duì)葡萄糖代謝障礙會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，胰島素抵抗除了與胰島素分泌不足有關(guān)，更主要是由機(jī)體對(duì)胰島素的不敏感狀況導(dǎo)致的。從細(xì)胞學(xué)角度上來(lái)看，機(jī)體對(duì)胰島素的不敏感反應(yīng)，可能是由于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路異常。胰島素信號(hào)通路的相關(guān)蛋白主要包括IR、IRS、GSK3β、Akt、GLUT4等，這些蛋白的表達(dá)及功能行使異常都有可能會(huì)導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路的傳遞障礙，從而加劇機(jī)體的胰島素抵抗。如圖6所示，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織中p-IRS、IR、p-IR和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚低、高劑量組骨骼肌組織IR、p-IR和p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），黑樹(shù)莓多酚高劑量組p-IRS蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織中p-IRS、IR和p-IR蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚高劑量組p-IRS、IR、p-IR和GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）。

3.8 黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病小鼠骨骼肌GLUT4及AMPKα1 mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織中及mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚低、高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌組織中及mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化；與模型組比較，黑樹(shù)莓多酚高劑量組及mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖6 黑樹(shù)莓多酚對(duì)STZ (A)及AXN (B) 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖7 黑樹(shù)莓多酚對(duì)STZ (A)及AXN (B) 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中GLUT4及AMPKα1mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

本研究采用STZ或AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，考察黑樹(shù)莓多酚對(duì)小鼠空腹血糖、糖耐受能力、并發(fā)癥的作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型的建立方法主要分為高脂飲食誘導(dǎo)法[14]、化學(xué)誘導(dǎo)法[15]、高脂飲食結(jié)合化學(xué)誘導(dǎo)法和基因敲除方法等[16]。其中，STZ及AXN作為最常見(jiàn)的化學(xué)誘導(dǎo)藥物得到了廣泛應(yīng)用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，相同劑量下，AXN誘導(dǎo)的小鼠糖尿病癥狀較STZ明顯。黑樹(shù)莓多酚飲食顯著降低STZ及AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平；黑樹(shù)莓多酚顯著上調(diào)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中p-IRS、IR、p-IR和p-Akt蛋白表達(dá)水平，顯著上調(diào)mRNA表達(dá)水平，但對(duì)GSK3β蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，這可能由于在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，黑樹(shù)莓多酚對(duì)GLUT4的活化作用并不是通過(guò)刺激GLUT4上游關(guān)鍵蛋白AMPK和GSK3β導(dǎo)致的，可能通過(guò)其他通路激活A(yù)kt從而導(dǎo)致下游GLUT4的活化[19]，其具體靶點(diǎn)還需進(jìn)一步探究；黑樹(shù)莓多酚顯著上調(diào)AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠骨骼肌中p-IRS、IR、p-IR和GSK3β蛋白表達(dá)水平，顯著上調(diào)及mRNA表達(dá)水平。綜上，黑樹(shù)莓多酚能夠上調(diào)2種糖尿病小鼠模型骨骼肌中胰島素信號(hào)通路上游蛋白IR、IRS的磷酸化水平，但對(duì)下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白GLUT4的活化作用有所不同。黑樹(shù)莓多酚對(duì)AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型GLUT4轉(zhuǎn)錄活化是通過(guò)刺激GLUT4上游關(guān)鍵蛋白AMPK實(shí)現(xiàn)的，對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型GLUT4轉(zhuǎn)錄活化的作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步探究。

糖尿病是一種由多病因引起的以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病?；颊哐情L(zhǎng)期升高，大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等[20]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病并發(fā)癥高達(dá)100多種，是目前已知并發(fā)癥最多的一種疾病，因此針對(duì)糖尿病并發(fā)癥對(duì)糖尿病的治療有著積極意義[21-22]。黑樹(shù)莓作為可食用的小漿果，其果實(shí)中富含多酚類化合物，本課題組前期研究結(jié)果提示，通過(guò)改善膳食結(jié)構(gòu)，飲食添加一定量黑樹(shù)莓多酚，亦或是單獨(dú)開(kāi)發(fā)黑樹(shù)莓多酚相關(guān)制劑，對(duì)于糖尿病的輔助治療有積極價(jià)值。黑樹(shù)莓多酚對(duì)糖尿病并發(fā)癥的緩解作用，主要從血脂水平、臟器指數(shù)、肝臟炎癥3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估。STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血脂水平和臟器指數(shù)并未發(fā)生明顯變化，可能是由于STZ主要損傷胰島細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)血糖代謝異常，而對(duì)脂類代謝的調(diào)控并不明顯。黑樹(shù)莓多酚顯著降低AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中血脂水平和腎臟指數(shù)。肝臟是脂類代謝的主要場(chǎng)所，在糖尿病糖脂代謝紊亂的條件下，肝臟負(fù)擔(dān)加重，產(chǎn)生炎性反應(yīng)并作為并發(fā)癥加劇糖尿病的發(fā)展。黑樹(shù)莓多酚顯著抑制AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟中、、和mRNA表達(dá)水平，表明黑樹(shù)莓多酚飲食可以明顯緩解AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠并發(fā)癥。

綜上所述，黑樹(shù)莓多酚可以通過(guò)調(diào)控胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖代謝，緩解STZ及AXN誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中血糖代謝紊亂引發(fā)的相關(guān)癥狀。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Pourhanifeh M H, Hosseinzadeh A, Dehdashtian E,. Melatonin: New insights on its therapeutic properties in diabetic complications [J]., 2020, 12: 30.

[2] Tan S Y, Mei Wong J L, Sim Y J,. Type 1 and 2 diabetes mellitus: A review on current treatment approach and gene therapy as potential intervention [J]., 2019, 13(1): 364-372.

[3] Sasaki M, Nishida N, Shimada M. A beneficial role of rooibos in diabetes mellitus: A systematic review and meta-analysis [J]., 2018, 23(4): 839.

[4] ?ztürk E, Arslan A K K, Yerer M B,. Resveratrol and diabetes: A critical review of clinical studies [J]., 2017, 95: 230-234.

[5] Vargas E, Podder V, Carrillo Sepulveda M A.[M]. Treasure Island: StatPearls, 2021.

[6] Parry J, Su L, Moore J,. Chemical compositions, antioxidant capacities, and antiproliferative activities of selected fruit seed flours [J]., 2006, 54(11): 3773-3778.

[7] Chen L L, Jiang B W, Zhong C G,. Chemoprevention of colorectal cancer by black raspberry anthocyanins involved the modulation of gut microbiota and SFRP2 demethylation [J]., 2018, 39(3): 471-481.

[8] Guo J, Yang Z, Zhou H R,. Upregulation of DKK3 by miR-483-3p plays an important role in the chemoprevention of colorectal cancer mediated by black raspberry anthocyanins [J]., 2020, 59(2): 168-178.

[9] Zhang H, Guo J, Mao L P,. Up-regulation of miR-24-1-5p is involved in the chemoprevention of colorectal cancer by black raspberry anthocyanins [J]., 2019, 122(5): 518-526.

[10] Prior R L, Wilkes S, Rogers T,. Dietary black raspberry anthocyanins do not alter development of obesity in mice fed an obesogenic high-fat diet [J]., 2010, 58(7): 3977-3983.

[11] Jeong H S, Hong S J, Lee T B,. Effects of black raspberry on lipid profiles and vascular endothelial function in patients with metabolic syndrome [J]., 2014, 28(10): 1492-1498.

[12] Xiao T, Guo Z H, Bi X L,. Polyphenolic profile as well as anti-oxidant and anti-diabetes effects of extracts from freeze-dried black raspberries [J]., 2017, 31: 179-187.

[13] Bi X L, Fang W F, Wang L S,. Black raspberries inhibit intestinal tumorigenesis in Apc1638+/–and Muc2–/–mouse models of colorectal cancer [J]., 2010, 3(11): 1443-1450.

[14] Islam M S, Loots du T. Experimental rodent models of type 2 diabetes: A review [J]., 2009, 31(4): 249-261.

[15] Radenkovi? M, Stojanovi? M, Prostran M. Experimental diabetes induced by alloxan and streptozotocin: The current state of the art [J]., 2016, 78: 13-31.

[16] 唐藝丹, 王鮮忠, 張姣姣. II型糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2020, 28(6): 870-876.

[17] 王芳, 朱大菊, 孫明謹(jǐn), 等. 鏈脲菌素在糖尿病鼠模型中的應(yīng)用及其作用機(jī)理 [J]. 鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 23(1): 15-17.

[18] 王曉穎, 段有金, 董瑤, 等. 四氧嘧啶實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的復(fù)制及其發(fā)病機(jī)制的探討[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐, 2002, 17(7): 802-803.

[19] Turan B, Tuncay E, Vassort G. Resveratrol and diabetic cardiac function: Focus on recentandstudies [J]., 2012, 44(2): 281-296.

[20] 孫天慧. 2型糖尿病慢性并發(fā)癥的臨床特點(diǎn)及其影響因素分析 [D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2020.

[21] 黃一青, 楊崢. 2型糖尿病健康教育研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2013, 29(7): 1042-1044.

[22] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì). 中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013年版) [J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志: 電子版, 2015, 7(3): 26-89.

Regulation and mechanism of polyphenol fromon blood sugar metabolism in diabetic mice

CHEN Li-li, LIU Yue, NIU Xiao-qi, LIU Wei, BI Xiu-li

College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China

To explore the blood sugar regulation and mechanism of polyphenol fromon blood sugar in diabetic mice.Diabetes models induced by streptozotocin and alloxan were established in mice, after fed with feed containing polyphenol from, blood glucose of mice in each group were detected; Kit was used to detect levels of triglyceride (TG) and total cholesterol (CHO) in serum of mice in each group; The effect of polyphenol fromon organ index of diabetic mice were investigated; qRT-PCR method was used to investigate the effect of polyphenol fromon interleukin-1 (),, cyclooxygenase 2 (), tumor necrosis factor-α () mRNA expressions in liver and glucose transporter 4 (), AMP-activated protein kinase α1 () mRNA expressions in skeletal muscle of diabetic mice; Western blotting was used to detect the effect of polyphenol fromon expression of insulin signaling pathway-related proteins in skeletal muscle of diabetic mice.Polyphenol fromsignificantly reduced fasting blood glucose and glucose tolerance in diabetic mice induced by streptozotocin and alloxan (< 0.05, 0.01), reduced levels of TG and CHO in serum of diabetic mice induced by alloxan (< 0.05), reduced the kidney index of diabetic mice induced by alloxan (< 0.05), reduced,,andmRNA expressions in liver of diabetic mice induced by alloxan (< 0.05, 0.01), up-regulated phosphorylated insulin receptor substrate (p-IRS), insulin receptor (IR), phosphorylated IR (p-IR) and phosphorylated protein kinase B (p-Akt) expressions in skeletal muscle of diabetic mice induced by streptozotocin (< 0.05, 0.01), up-regulatedmRNA expression levels (< 0.05), up-regulated p-IRS, IR, p-IR and glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) expressions in skeletal muscle of diabetic mice induced by alloxan (< 0.05), and up-regulatedandmRNA expressions (< 0.05, 0.01).Polyphenol fromcan alleviate the symptoms caused by disorders of blood glucose metabolism in diabetic mice induced by streptozotocin and alloxan through activating the insulin signaling pathway and promoting glucose metabolism.

polyphenol fromH. Lévl.; diabetes; glucose tolerance; blood lipids; organ index; insulin signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2021)17 - 5258 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.018

2021-07-26

陳麗莉（1990—），女，博士研究生，研究方向?yàn)榇x類疾病及腫瘤化學(xué)預(yù)防。E-mail: lilychen723@163.com

畢秀麗（1977—），女，沈陽(yáng)藥科大學(xué)2000級(jí)碩博連讀，藥理學(xué)專業(yè)校友，博士生導(dǎo)師，教授，遼寧省首批“興遼英才”計(jì)劃入選者，遼寧省“百千萬(wàn)人才工程”百層次人選，沈陽(yáng)市高層次領(lǐng)軍人才，研究方向?yàn)榇x類疾病及腫瘤化學(xué)預(yù)防。E-mail: xiulibi@gmail.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]