Ⅱ型心腎綜合征動(dòng)物模型研究進(jìn)展

查玉玲,孔淼,周育平*,張文杰

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

心腎綜合征(Cardiorenal Syndrome,CRS)是心臟或腎中某一器官發(fā)生急性或慢性病變引起另一個(gè)器官的急性或慢性病變[1],分為5種亞型。I型和II型是指心力衰竭(heart failure,HF)引起腎功能損害。研究表明,大于1/4的HF患者合并腎功能不全[2],腎損害是HF死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。由于I型CRS起病急,發(fā)病快,病情重和致死率高,臨床治療措施局限,而II型CRS是許多心血管疾病的共同轉(zhuǎn)歸和結(jié)局,是近年HF領(lǐng)域研究的焦點(diǎn),因此本文主要研究II型CRS動(dòng)物模型。

CRS機(jī)制研究主要包括:血流動(dòng)力學(xué)異常(靜脈淤血及灌注不足),神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能異常和貧血等[4],主要生物標(biāo)記物包括:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)、B型鈉酸肽(BNP)或NT-proBNP、Galectin-3、a-Klotho蛋白、胱抑素C(CysC)等[5]。有關(guān)CRS發(fā)病機(jī)制研究已有進(jìn)展,但尚不明確,尋找合適的動(dòng)物模型有助于明確CRS病理過程,系統(tǒng)探究其內(nèi)在規(guī)律。

1 單一模型

1.1 心力衰竭動(dòng)物模型

血流動(dòng)力學(xué)改變是CRS發(fā)病最初驅(qū)動(dòng)力。HF發(fā)生時(shí),心輸出量減少導(dǎo)致腎灌注不足,以及中心靜脈壓(CVP)升高,腎靜脈淤血,均可造成腎小球?yàn)V過率下降。過度激活的腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)導(dǎo)致血管收縮,水鈉潴留,血管內(nèi)皮功能受損,血管彈性降低,血壓升高,加重腎灌注受損。因此HF模型從理論上可以作為CRS模型使用。

1.1.1 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎動(dòng)物模型

冠脈結(jié)扎通過造成冠脈管腔變窄,影響心臟血流供應(yīng),長期易導(dǎo)致心衰,與人類缺血性心衰機(jī)制相似,冠狀動(dòng)脈結(jié)扎(MI)術(shù)是構(gòu)建心梗后HF的經(jīng)典模型。Harrison等[6]通過MI術(shù)構(gòu)建2型CRS模型,術(shù)后90 d大鼠出現(xiàn)心梗后HF,心室重量增加,左室舒張功能受損且壓力升高,肌酐清除率明顯降低,腎基底膜增厚,腎小球?yàn)V過率降低。該模型提供了由HF導(dǎo)致腎損傷的確鑿的形態(tài)、生化和功能證據(jù),是2型CRS代表模型。郝慧鑫[7]采用MI術(shù),6周后觀察到小鼠腎破壞明顯,小鼠心臟、腎纖維化(腎小球和間質(zhì))程度、NGAL表達(dá)量、血肌酐(SCr)水平明顯升高。Krishnan等[8]采用MI術(shù),觀察到大鼠心室后壁變薄,炎性細(xì)胞浸潤,腎纖維化,腎小管壞死。Qiu等[9]采用MI術(shù),28 d后大鼠左室收縮末和舒張末內(nèi)徑顯著升高,左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(LVFS)顯著降低,腎主動(dòng)脈阻力指數(shù)升高,血管緊張素II(AngII)、尿素氮(BUN)、環(huán)磷鳥苷(cGMP)和SCr濃度升高,腎小管擴(kuò)張明顯,腎間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。

雖然MI術(shù)在確定終點(diǎn)事件時(shí)操作方法不盡相同,最終病理變化也存在差異,但都成功模擬出CRS病理過程。目前此類模型成模觀察時(shí)間在4~6周[6],造模的成功率與結(jié)扎部位高低以及操作人員熟練能力有直接關(guān)系,目前成功率一般>70%[6-7,9]。Duan等[10]提出MI術(shù)能激活大鼠體內(nèi)RAAS系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)中注射外源性AngII可以增加HF大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

1.1.2 主動(dòng)脈縮窄動(dòng)物模型

主動(dòng)脈縮窄(TAC)術(shù)通過造成主動(dòng)脈血流受阻,血壓增高,誘導(dǎo)左室增生肥厚,是研究壓力負(fù)荷性HF的常見模型。Kamal等[11]通過TAC術(shù)構(gòu)建CRS模型,術(shù)后4~6周小鼠開始出現(xiàn)HF,當(dāng)小鼠出現(xiàn)晚期非缺血性慢性HF時(shí),小鼠SCr和腎損傷標(biāo)記物1(KIM-1)表達(dá)增加,心腎出現(xiàn)纖維化。研究顯示HF小鼠模型誘導(dǎo)腎功能惡化、腎小管間質(zhì)重塑和炎癥發(fā)展無需手術(shù)操作來實(shí)現(xiàn),優(yōu)于缺血性心臟損傷和腎損傷相結(jié)合的方法,減少了實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷。Zhao等[12]采用TAC術(shù),術(shù)后8周小鼠心臟β-肌球蛋白重鏈(β-MHC),基質(zhì)纖連蛋白和促炎性腫瘤壞死因子-α(TNF-α)明顯增加,同時(shí)小鼠腎小球足細(xì)胞標(biāo)志物podocalyxin的表達(dá)受到抑制,出現(xiàn)纖連蛋白和Snail1的腎表達(dá)。這表明TAC可能觸發(fā)了心臟Wnt/β-catenin途徑激活心臟RAAS和促炎性細(xì)胞因子釋放,而循環(huán)細(xì)胞因子(例如TNF-α)反向抑制了腎中的klotho蛋白表達(dá),從而導(dǎo)致腎損傷。

TAC術(shù)可重復(fù)性強(qiáng),且HF呈現(xiàn)漸進(jìn)性發(fā)展,可以觀察心臟從代償走向失代償?shù)纳聿±碜兓?可以很好地模擬CRS病理過程。目前此類模型成模觀察時(shí)間在4~8周[11-12],有研究提示近心端結(jié)扎腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)致CHF癥狀及程度更明顯,但是成活率相對降低,為60%,實(shí)驗(yàn)難度相對增大[13]。

1.1.3 自發(fā)性高血壓模型

自發(fā)性高血壓(SHR)模型多用于高血壓研究,與RAAS、NO、免疫炎癥、血管功能障礙等機(jī)制有關(guān)[14]。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)老年雄性SHR大鼠9周齡時(shí)收縮壓開始升高,65周>150 mmHg,平均動(dòng)脈壓(199.0±8.1)mmHg;左室肥厚(LVH)隨年齡增加而增加,且老年SHR大鼠RAAS活性增強(qiáng),尿蛋白和白蛋白排泄增加,出現(xiàn)腎小球硬化和壞死、腎小管細(xì)胞凋亡、腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤、心腎小血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。

SHR模型在自然條件下產(chǎn)生的,與人類相應(yīng)疾病近似,很好地模擬臨床心腎損傷的自然過程。其成模周期、成模率不需要實(shí)驗(yàn)者考慮,比較便捷,但目前由于其仍受到培養(yǎng)周期長、環(huán)境要求高、動(dòng)物價(jià)格高等因素的影響,所以在實(shí)際應(yīng)用中仍受到一定的限制[16]。

1.1.4 給藥動(dòng)物模型

Angelini等[17]腹腔注射野百合堿(MCT)30 mg/kg誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓性右室衰竭,術(shù)后大鼠出現(xiàn)較高BNP水平,血清促炎型細(xì)胞因子、胰蛋白酶、腎和心臟組織NGAL水平升高,右室肥厚擴(kuò)張,伴有胸腹腔積液出現(xiàn)。Matsushita等[18]使用注射氯化鉀聯(lián)合心肺復(fù)蘇法誘發(fā)急性CRS模型,術(shù)后小鼠出現(xiàn)急性腎損傷,表現(xiàn)出少尿、腎小球?yàn)V過率降低、腎小管上皮細(xì)胞損傷/死亡、炎癥浸潤等現(xiàn)象。該模型死亡率高,可重復(fù)性低,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差。歐陽過等[19]采用腹腔注射阿霉素3 mg/kg,術(shù)后模型大鼠心腎功能出現(xiàn)損傷,心肌及腎組織細(xì)胞凋亡率、血清NTproBNP、KIM-1含量均增加。

本模型與人體CRS發(fā)生過程存在一定差異。目前在給藥模型中,野百合堿模型成模率在70%~80%,造模時(shí)間在4周左右,有研究提示50 mg/kg劑量組野百合堿誘導(dǎo)的動(dòng)物模型更為接近大鼠肺動(dòng)脈模型的理想數(shù)值[20]。氯化鉀聯(lián)合心肺復(fù)蘇法成模率在37%~60%,臨床死亡率較高,造模時(shí)間在7周左右[18}。阿霉素注射臨床成模率在40%~60%,與阿霉素的注射速度、累積劑量均有關(guān)聯(lián),有研究提示以2 mL/kg體重劑量腹腔注射,每周1次,共6周,累積總量24 mg/kg體重可以構(gòu)建心衰模型[21]。

1.1.5 動(dòng)靜脈瘺動(dòng)物模型

Aboryag等[22]采用腎下主動(dòng)脈腔瘺(ACF)法構(gòu)建大鼠HF模型,術(shù)后28 d大鼠心肺重量指數(shù)明顯增加,CVP、左室舒張末期壓力和容積、左室收縮末期容積顯著升高,LVEF顯著降低,腎小球出現(xiàn)萎縮性改變,Bowman腔變寬,腎小球結(jié)構(gòu)、近曲小管結(jié)構(gòu)明顯改變,出現(xiàn)上皮脫落和刷緣丟失等現(xiàn)象,這些發(fā)現(xiàn)提供了HF導(dǎo)致腎損傷的形態(tài)學(xué)證據(jù),支持了CRS的病理過程。Abu等[23]采用大鼠腹主動(dòng)脈和下腔靜脈間造瘺術(shù),術(shù)后大鼠尿流量和腎小球?yàn)V過率明顯降低,鈉排泄、腎血漿流量明顯下降,腎小管損傷,尿NAGL絕對排泄量顯著增加。

動(dòng)靜脈瘺手術(shù)造成局部血流動(dòng)力學(xué)改變,可以用于研究血流動(dòng)力學(xué)對CRS的影響,然而小動(dòng)物靜脈薄且脆,臨床上大動(dòng)物模型的解剖結(jié)構(gòu)更接近于臨床狀況,因此血液動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力研究一般選用大型動(dòng)物模型[24-25]。目前動(dòng)靜脈瘺成模時(shí)間為(28±2)d[22],大型動(dòng)物模型臨床成模率較高,大部分在90%~100%,但是大型動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)成本較高[25]。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

基因小鼠模型目前被認(rèn)為是最具前景的動(dòng)物模型。Pleasant等[26]采用心肌細(xì)胞特異性高表達(dá)突變體αβ-晶體蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,與野生型(WT)相比,轉(zhuǎn)基因小鼠的SCr、NAGL、腎小管腎素蛋白表達(dá)均明顯增高,這些為無癥狀HF小鼠模型腎內(nèi)RAAS的早期活化提供了證據(jù)。Giam等[27]采用擴(kuò)張型心肌病(DCM)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,發(fā)現(xiàn)DCM小鼠的腎小管間質(zhì)和腎小球纖維化程度(分別為88%和73%)高于同齡WT小鼠,腎氧化性谷胱甘肽水平比WT小鼠高40%,舒張期和收縮期室間隔厚度分別比WT小鼠少35%和44%,收縮期左室后壁厚度比WT小鼠減少25%,這些數(shù)據(jù)說明2型CRS模型與腎炎癥,谷胱甘肽缺乏和纖維化有關(guān)。Klotho基因編碼的a-Klotho蛋白,在臨床研究中被認(rèn)為有心腎的雙重保護(hù)作用。劉熹等[28]發(fā)現(xiàn)下調(diào)或者敲除a-Klotho基因,可以加重心、腎損傷。

轉(zhuǎn)基因小鼠模型遺傳背景相對穩(wěn)定,突變方向人工可控,對研究CRS病理機(jī)制,開發(fā)新藥物具有一定的優(yōu)勢。當(dāng)然其操作要求更高,造模成本相應(yīng)增加見表1。

表1 II型CRS單一模型一覽表Figure 1 List of type II CRSsingle models

2 復(fù)合動(dòng)物模型

與單式模型相比,復(fù)合模型在展現(xiàn)心腎之間互為影響的病理過程時(shí)更加貼近臨床實(shí)際。但是在臨床研究中,著重點(diǎn)往往在于觀察指標(biāo)的情況,對于復(fù)合模型的造模成功率、造模時(shí)間關(guān)注較少。

2.1 冠脈結(jié)扎聯(lián)合腎切除動(dòng)物模型

冠脈結(jié)扎聯(lián)合腎切除是目前CRS造模最常用的方法之一。韋震鳴等[29]采用MI聯(lián)合5/6腎切除術(shù),手術(shù)以心肌缺血發(fā)白,腎缺血發(fā)白面積在5/6左右為造模成功,造模兩次手術(shù)間隔時(shí)間1周,存活率53.84%,這種方法不僅縮短了造模周期,降低了死亡率,而且在明顯誘導(dǎo)出慢性心腎功能受損及心肌組織纖維化的基礎(chǔ)上保持了器官的完整性,提高了實(shí)驗(yàn)的效率和穩(wěn)定性。吳英智[30]采用MI聯(lián)合3/4腎切除進(jìn)行造模,大鼠存活77.8%,MI術(shù)后2周(腎切術(shù)后1周),模型大鼠SCr、BUN、BNP明顯升高,MI術(shù)后4周(腎切術(shù)后3周),24 h尿蛋白、心臟質(zhì)量指數(shù)、左腎質(zhì)量指數(shù)明顯升高,心臟和腎HE染色非梗死區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤和纖維結(jié)締組織生長。吳氏認(rèn)為減少腎切面積,可簡化手術(shù)過程,降低死亡率,造模早期心功能和腎功能即明顯下降,符合CRS發(fā)病過程中心、腎相互作用和病程發(fā)展的的病理特點(diǎn)。段曉宇等[31]通過MI術(shù)結(jié)合腎急性缺血再灌注損傷制備CRS模型,術(shù)后大鼠血中Cys-C、SCr、Ang II、尿微量白蛋白(UMA)和NGAL含量均顯著升高,腎損傷嚴(yán)重。盛曉生等[32]采用左腎切除聯(lián)合MI術(shù),造模后CRS組血清中和肽素(CPP)、SCr、尿肌酐(UCr)、BUN均顯著升高,CPP作為AVP前體羧基末端的一段多肽,在血中長期保持穩(wěn)定,利于檢測,可作為生物標(biāo)志物替代AVP的檢測。

雖然構(gòu)建心腎復(fù)合模型時(shí),心腎損傷面積并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),但此類模型臨床指標(biāo)較為完善,有利于揭示心腎互相影響的臨床機(jī)制。此類復(fù)合模型因?yàn)榧毙訡RS模型和慢性CRS模型差別,造模周期存在差異。

2.2 藥物聯(lián)合腎切除模型

吳翔等[33]采用鹽酸多柔比星腹腔注射聯(lián)合5/6腎切除術(shù),術(shù)后大鼠LVFS、LVEF明顯下降,心臟組織細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)、心肌細(xì)胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高,心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高,說明腎功能不全可以促進(jìn)心功能不全的發(fā)展。Yang等[34]采用5/6腎切除聯(lián)合腹腔注射阿霉素(累積量7.5 mg/kg)和每日高蛋白飲食誘導(dǎo)CRS,術(shù)后第63天時(shí),模型大鼠BUN和Cr以及尿蛋白/肌酐顯著升高。

本方法簡捷高效,與單一腎切除造模時(shí)間相似[35],由于藥物毒性作用很難控制劑量以及排除對其他器官的干擾,給藥聯(lián)合手術(shù)的方式增加了實(shí)驗(yàn)的難度,具有一定的局限性(見表2)。

表2 II型CRS復(fù)合模型一覽表Figure 2 List of type II CRScomposite models

3 討論

無論是外科手術(shù)、藥物模型、單式模型、復(fù)式模型還是轉(zhuǎn)基因模型,均一定程度反映了CRS病理機(jī)制,但并非完美地模擬了CRS發(fā)病和進(jìn)展過程,故需要探索優(yōu)質(zhì)模型以模擬心腎之交互作用,以及伴隨的血液動(dòng)力學(xué)和全身代償機(jī)制的激活,為藥物治療評價(jià)提供手段。