丙烯酰胺對(duì)小鼠血液毒性的研究

王小博,梁斯,陳齊,鄭琳*,俞鳴鋏,劉健南,陳冰冰

(1.佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系,廣東 佛山 528137;2.佛山市疾病預(yù)防控制中心,廣東 佛山 528000)

丙烯酰胺(acrylamide)是一種白色晶體,易溶于水、乙醇、甲醇等極性溶劑,在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用為生產(chǎn)聚丙烯酰胺及其同聚物的中間體[1]。丙烯酰胺是一種中等毒性的毒物,極易被生物體的消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收,引起急慢性中毒[2-3],其具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、致畸性和致癌性[4-5]。丙烯酰胺是美拉德反應(yīng)的一種副產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn),一些油炸、焙烤的淀粉類食品中存在大量的丙烯酰胺[6]。近年來丙烯酰胺對(duì)人體健康的影響越來越受到大家的關(guān)注,丙烯酰胺的毒性效應(yīng)也越來越受到大家的重視。目前針對(duì)丙烯酰胺毒性的研究主要集中在其神經(jīng)毒性,而丙烯酰胺對(duì)生物機(jī)體血液毒性的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過不同劑量丙烯酰胺灌胃小鼠,記錄體重、器官指數(shù)變化,對(duì)血液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分析,以此來識(shí)別丙烯酰胺對(duì)小鼠血液毒性作用,為研究丙烯酰胺潛在危害提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只(雌雄各半)4~6周齡SPF級(jí)KM小鼠,體重20~30 g,購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(桂)2020-0004】,實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(桂)2020-0003】。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好,飼養(yǎng)期間各組小鼠均提供充足飲水和飼料,室溫18~25℃,相對(duì)濕度40%~70%,12 h光照晝夜循環(huán)。待小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有操作均獲得廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):201808009)。

1.1.2 主要試劑與儀器

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(Enzo,USA,純度≥98%)購自于上海穎心實(shí)驗(yàn)室;堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(VREA)、尿酸(UA)檢測(cè)試劑盒購自西寶生物科技(上海)股份有限公司。

酶標(biāo)儀(Multiskan FC,Thermo,美國(guó));臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Universal320,Hettich,德國(guó));血常規(guī)分析儀(URIT-2981,武漢醫(yī)盾醫(yī)療器械有限公司,中國(guó));電子天平(PGC-453E,艾德姆衡器武漢有限公司,中國(guó));恒溫水浴鍋(HH-4,金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥方式

將體重相當(dāng)、健康的SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)分為6大組,每組8只。丙烯酰胺的半數(shù)致死劑量一般高于150 mg/kg[7],因此本研究設(shè)定不同劑量的丙烯酰胺(30、60、90、120、150 mg/kg),采用經(jīng)口灌胃方式對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)染毒16 d,每10 g體重灌胃0.1 mL丙烯酰胺溶液。對(duì)照組灌胃同等體積的生理鹽水,每日灌胃1次,實(shí)驗(yàn)期間小鼠正常喂食、飲水。

1.2.2 小鼠形態(tài)觀察和增重率測(cè)定

每天定時(shí)觀察并記錄小鼠的采食量及精神狀態(tài)。在每天灌胃和喂食之前,稱量體重,計(jì)算每天的增重率。

式中:Wi為第i天小鼠體重(g);W0為實(shí)驗(yàn)初始時(shí)小鼠體重(g)。

在抓實(shí)生態(tài)文明體制改革的同時(shí)，云南省環(huán)境污染第三方治理、環(huán)境監(jiān)管執(zhí)法工作、水污染防治和水功能區(qū)管理等改革取得突破。狠抓中央環(huán)境保護(hù)督察反饋問題的整改落實(shí)，建立省級(jí)環(huán)保督察機(jī)制，全省實(shí)現(xiàn)對(duì)16個(gè)州市環(huán)境保護(hù)督察全覆蓋。

1.2.3 小鼠血液指標(biāo)血常規(guī)分析

第17天對(duì)小鼠尾部采血30~40μL,并立即進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

1.2.4 小鼠血液相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

第17天對(duì)小鼠眼部取血并處死,分離其心、肝、脾、胃、腎、肺稱重后計(jì)算各劑量組小鼠的器官系數(shù),并測(cè)定血清中AST、ALT、AKP、BUN、CREA、UA指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行處理,采用ANOVA中的LSD多重比較進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05表示為差異具有顯著性;通過Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠形態(tài)觀察和體重增長(zhǎng)率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)照組小鼠攝食,飲水正常,精神狀態(tài)較好;實(shí)驗(yàn)初期染毒組小鼠攝食,飲水正常,第8天后,各染毒組小鼠攝食減少,高劑量組(120、150 mg/kg)小鼠活動(dòng)減少,精神萎靡;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各劑量組小鼠體重均有所增加;與對(duì)照組相比,當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),小鼠體重增重率變化顯著(P<0.05)(見圖1)。

圖1 染毒小鼠增重率變化Note.Compared with the control group,*P<0.05.Figure 1 Change of weight gain rate in mice exposed

2.2 丙烯酰胺對(duì)小鼠器官系數(shù)的影響

與對(duì)照組比,不同劑量組小鼠的心、脾、胃、肺器官系數(shù)略有下降(見表1),但無明顯差異(P>0.05),說明了當(dāng)丙烯酰胺濃度<150 mg/kg時(shí),對(duì)小鼠的心、脾、胃、肺器官未有明顯的毒性作用。與對(duì)照組比,當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),小鼠肝系數(shù)顯著下降(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為90、120、150 mg/kg時(shí),小鼠腎系數(shù)顯著下降(P<0.05)。

表1 丙烯酰胺對(duì)小鼠器官系數(shù)的影響(n=8)Table 1 Effect of acrylamide on the organ coefficient of mice(n=8)

2.3 小鼠白細(xì)胞系統(tǒng)分析

連續(xù)灌胃16 d后,小鼠血液中WBC、LYM隨著染毒濃度的增加逐步下降,GRAN隨著染毒濃度的增加而增加(見表2)。與對(duì)照組相比,當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),WBC、LYM下降顯著(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),GRAN顯著增加(P<0.05)。由此說明,高濃度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)會(huì)對(duì)小鼠的白細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。

表2 丙烯酰胺對(duì)小鼠白細(xì)胞系統(tǒng)的影響(n=8)Table 2 The effect of acrylamide on the white blood cell system of mice(n=8)

2.4 小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)分析

連續(xù)灌胃16 d之后,小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)中RBC、HGB、MCV、MCH、MCHC等各項(xiàng)指標(biāo)與試驗(yàn)之前相比呈輕微下降趨勢(shì)(見表3)。與對(duì)照組比,當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),RBC、MCHC下降顯著(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為90、120、150 mg/kg時(shí),HGB下降顯著(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為150 mg/kg時(shí),MCV下降顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,中高濃度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)對(duì)小鼠的紅細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生較大的毒性作用。

表3 丙烯酰胺對(duì)小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)的影響(n=8)Table 3 Effect of acrylamide on the red blood cell system of mice(n=8)

2.5 小鼠血小板系統(tǒng)分析

分別連續(xù)灌胃16 d之后,隨著染毒劑量的增加小鼠血小板系統(tǒng)中PLT、PCT和P-LCR均下降(見表4)。與對(duì)照組比,當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),PLT、P-LCR下降顯著(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為150 mg/kg時(shí),PCT顯著下降(P<0.05)。由此說明,高濃度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)會(huì)對(duì)小鼠的血小板系統(tǒng)帶來一定得毒性效應(yīng)。

表4 丙烯酰胺對(duì)小鼠血小板系統(tǒng)的影響(n=8)Table 4 Effect of acrylamide on the platelet system of mice(n=8)

2.6 小鼠血清生化指標(biāo)的測(cè)定

如圖2所示隨著染毒劑量的增加,小鼠血清中的ALT活性也隨之增加,與對(duì)照組相比,當(dāng)染毒劑量為90、120 mg/kg時(shí),ALT酶活性顯著升高(P<0.05),當(dāng)染毒劑量為150 mg/kg時(shí),ALT酶活性升高極顯著(P<0.01)。小鼠血清中的AST活性隨著染毒劑量的增加,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)染毒劑量為60 mg/kg時(shí),AST活性達(dá)到最大;與對(duì)照組相比,AST活性增加極其顯著(P<0.01)。小鼠血清中的AKP活性隨著染毒劑量的增加也隨之增加,與對(duì)照組相比,當(dāng)染毒劑量≥60 mg/kg時(shí),AKP活性增加顯著(P<0.05),當(dāng)染毒劑量為90、120 mg/kg時(shí),AKP活性增加極顯著(P<0.01)。當(dāng)染毒劑量為120 mg/kg時(shí),BUN含量達(dá)到最大,與對(duì)照組相比增加極顯著(P<0.01)。隨著染毒劑量的增加,CREA、UA含量隨之增加;當(dāng)染毒劑量≥60 mg/kg時(shí),CREA含量增加顯著(P<0.05);當(dāng)染毒劑量≥90 mg/kg時(shí),UA含量也顯著增加(P<0.05);當(dāng)染毒劑量為120、150 mg/kg時(shí),CREA、UA含量增加極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,丙烯酰胺會(huì)引起小鼠血清各指標(biāo)發(fā)生變化,可作為丙烯酰胺毒性效應(yīng)的標(biāo)志物,劑量越高,反應(yīng)越明顯。

圖2 丙烯酰胺對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響(n=8)Note.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 2 Effect of acrylamide on serum biochemical indexes in mice(n=8)

3 討論

丙烯酰胺是食品加工過程中形成的一種主要的內(nèi)源污染物,可在食品中殘留,進(jìn)而導(dǎo)致食源性中毒。本研究對(duì)丙烯酰胺的血液毒性進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估,為丙烯酰胺毒性機(jī)理研究提供數(shù)據(jù)資料。研究表明經(jīng)口劑量大于100 mg/kg時(shí),丙烯酰胺能夠產(chǎn)生明顯的急性中毒效應(yīng)[8],這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

丙烯酰酰胺能夠刺激小鼠β-細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素分泌不足,進(jìn)而促使小鼠的進(jìn)食量增多,體重增加[9];同時(shí),丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)小鼠生物節(jié)律紊亂,大腦損傷,進(jìn)而促使體重增重率下降[7]。Tan等[10]發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞線粒體功能障礙,進(jìn)而造成肝損傷;Erdemli等[11]研究表明長(zhǎng)時(shí)間暴露丙烯酰胺會(huì)引起機(jī)體腎發(fā)生癌變。本研究通過對(duì)小鼠暴露不同濃度的丙烯酰胺,發(fā)現(xiàn)隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)小鼠體重增重率逐漸下降,肝、腎系數(shù)明顯降低。因此,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量丙烯酰胺(≥120 mg/kg)會(huì)導(dǎo)致小鼠體重增重率顯著下降,中高濃度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)會(huì)對(duì)小鼠肝、腎等器官產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)。

機(jī)體的生理變化和病理變化往往會(huì)導(dǎo)致血液成分發(fā)生改變,因此血液成分檢測(cè)具有重要的臨床意義[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明血液中丙烯酰胺的含量大約占攝入體內(nèi)的丙烯酰胺總量的12%[13]。血液對(duì)機(jī)體免疫有著極其重要的作用[14]。紅細(xì)胞系統(tǒng)中含有許多與免疫相關(guān)的物質(zhì),能夠識(shí)別、殺傷抗原,清除免疫復(fù)合物,并參與機(jī)體免疫調(diào)控的作用[15];白細(xì)胞系統(tǒng)中的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等不同細(xì)胞間比例的變化可作為免疫細(xì)胞顯微分化的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]。Panyod等[17]發(fā)現(xiàn)進(jìn)入血液的丙烯酰胺,會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致生物膜的破壞,白細(xì)胞系統(tǒng)受損,相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變。由于丙烯酰胺與血紅蛋白反應(yīng),生產(chǎn)血紅蛋白加合物,進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞系統(tǒng)受到損傷,造成各細(xì)胞指數(shù)下降[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量丙烯酰胺能引起小鼠WBC、LYM輕微下降,而GRAN卻明顯增加,說明丙烯酰胺會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)一定的炎癥。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠的RBC、HGB、MCHC顯著下降,說明高劑量的丙烯酰胺能引起小鼠輕度貧血。此外,血小板系統(tǒng)中PCT和P-LCR也下降,說明實(shí)驗(yàn)小鼠有骨髓造血功能下降的傾向。綜上,當(dāng)丙烯酰胺含量≥120 mg/kg時(shí)會(huì)導(dǎo)致小鼠機(jī)體產(chǎn)生炎癥、貧血、骨髓造血功能下降等癥狀。

ALT、AST主要存在于肝細(xì)胞中,是肝細(xì)胞受損傷時(shí)比較靈敏的指示性指標(biāo),肝細(xì)胞受損致使轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液里,血清轉(zhuǎn)氨酶隨之升高[19]。AKP主要來源于脊椎動(dòng)物肝和骨骼中。在臨床上ALT、AST和AKP是肝膽系統(tǒng)疾病診斷的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丙烯酰胺引起小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及AKP升高,同時(shí)肝的器官系數(shù)下降,說明中高劑量的(≥120 mg/kg)丙烯酰胺會(huì)對(duì)小鼠的肝功能造成一定的損傷。

CREA主要由磷酸肌酸水解產(chǎn)生,BUN是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,當(dāng)腎功能受到損害時(shí),其排出CREA和BUN的能力下降,血液中CREA和BUN濃度會(huì)升高。因此,檢測(cè)血液中CREA及BUN是判定腎功能是否受損的重要方法[13]。UA是機(jī)體嘌呤的最終產(chǎn)物,血清中的UA只有通過腎排出體外,當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降,或者腎小球UA的重吸收增加或者分泌減少時(shí),均可導(dǎo)致血清UA的含量升高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠暴露丙烯酰胺染后,血清CREA、BUN、UA的含量增加,染毒劑量越高增幅越明顯,且與對(duì)照組相比增加顯著,因此表明中高劑量(≥90 mg/kg)的丙烯酰胺暴露可引起小鼠腎功能性損傷。

4 結(jié)論

丙烯酰胺會(huì)導(dǎo)致小鼠生長(zhǎng)減緩,并對(duì)小鼠血液產(chǎn)生一定得毒性效應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥、貧血甚至降低造血功能。當(dāng)丙烯酰胺濃度≥60 mg/kg時(shí),小鼠血清指標(biāo)會(huì)發(fā)生明顯變化;中高濃度的丙烯酰胺(≥90 mg/kg)會(huì)對(duì)小鼠紅細(xì)胞系統(tǒng)、白細(xì)胞系統(tǒng)、肝、腎等器官產(chǎn)生一定的損傷效應(yīng)。高濃度的丙烯酰胺(≥120 mg/kg)會(huì)影響小鼠的體重增長(zhǎng),并對(duì)血小板系統(tǒng)造成明顯的損傷。