肝細(xì)胞癌原位與皮下PDX模型的方法學(xué)比較分析研究

朱瑞敏,李寶亮,路亞嵐,詹相文,劉益豪,韓云林,秦川,高苒*

(1.中國醫(yī)學(xué)科科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家人類疾病動(dòng)物模型資源庫 國家衛(wèi)生健康委員會

人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院,北京 100015)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一,最新研究表明其發(fā)病率和死亡率分別為第三和第二[1]。我國肝癌的發(fā)病率和死亡率約占全球的46.6%和47.1%[2]。該病患者發(fā)病隱匿,早期癥狀不明顯,確診時(shí)一般為中晚期,需接受放療和化療在內(nèi)的綜合治療方案。肝癌與其他腫瘤相似,化療以經(jīng)驗(yàn)性用藥為主。由于腫瘤患者的異質(zhì)性,個(gè)體差異較大,相同的病理診斷適用藥物不盡相同,對部分患者可能出現(xiàn)耐藥性延誤治療的最佳時(shí)機(jī)[3]。因此,為患者選擇個(gè)體化的治療方案是目前亟需解決的重要問題。

人源腫瘤異種移植(patient-derived xenografts,PDX)模型是通過手術(shù)或穿刺樣本植入免疫缺陷小鼠建立的個(gè)體化腫瘤模型[4]。該模型能夠高度維持原發(fā)瘤的組織病理學(xué)、遺傳異質(zhì)性和生長特征,在腫瘤藥物篩選以及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療方面具有極大優(yōu)勢[5-7]。根據(jù)PDX模型的移植部位主要包括皮下移植和原位移植[8]。皮下接種是目前最常用的植入方式,具有操作簡單、便于觀察等多種優(yōu)勢,但皮下不能提供腫瘤生長的適宜微環(huán)境,因此成瘤率相對較低,培養(yǎng)時(shí)間長[9];原位模型與原發(fā)性腫瘤生長環(huán)境相似,能夠模擬生長、浸潤和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種生物學(xué)行為,充分體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性,再者肝是一個(gè)造血器官之一,血供營養(yǎng)豐富,是理想的腫瘤移植模型[10]。目前國內(nèi)還未報(bào)道HCC的原位PDX模型,原位與皮下PDX模型的方法學(xué)比較更是一個(gè)空白。因此,本研究旨在探索一種HCC的原位PDX模型的構(gòu)建方法,并將原位移植模型與皮下模型進(jìn)行比較。

本文從北京地壇醫(yī)院收集新鮮的肝癌腫瘤組織,選擇NCG免疫缺陷小鼠構(gòu)建肝癌患者的原位和皮下PDX模型并進(jìn)行鑒定,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21只5~6周齡SPF級雄性NCG小鼠,體重18~22 g,用于構(gòu)建肝癌PDX模型,購自江蘇集萃藥康科技有限公司【SCXK(蘇)2018-0008】;NCG小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(京)2019-0014】,環(huán)境溫度24~26℃,光照12 h,黑暗12 h,小鼠均自由飲水取食,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所倫理委員會的批準(zhǔn)(GR18001)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)患者標(biāo)本

本實(shí)驗(yàn)所涉及的16例肝細(xì)胞癌標(biāo)本均收集自首都醫(yī)科大學(xué)附屬地壇醫(yī)院,腫瘤患者標(biāo)本取材使用均通過了倫理審查委員會的批準(zhǔn)(京地倫科字[2019]第(071)-02號)。

1.1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自以色列Biological Industries公司,PBS緩沖液購自美國Gibco公司,戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司,青霉素購自AMRESCO公司,10%中性多聚甲醛購自北京索萊寶生物科技有限公司,75%乙醇溶液購自山東安捷高科消毒科技有限公司;縫合線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司,1 mL注射器購自中國雙鴿集團(tuán)聚民生物科技有限公司,腰椎穿刺針購自揚(yáng)州市江州醫(yī)療器械有限公司,備皮刀購自吉康醫(yī)療器械有限公司,壓敏膠帶購自北京陽光益康科技發(fā)展有限責(zé)任公司,眼科鑷購自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠,眼用剪購自上海三友外科器材有限公司,持針器購自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠;生物安全柜購自美國Thermofisher-Scientific公司,核磁掃描儀購自美國Agilent公司,呼吸麻醉機(jī)購自美國Matrx公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌PDX模型原位接種方法

臨床肝癌患者手術(shù)切除組織標(biāo)本離體后立即放入含20%FBS的4℃RPMI-1640培養(yǎng)基中,24 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)操作。取適量組織切成小塊作為接種組織,并從剩余組織中,取適量放入10%中性甲醛溶液中固定,其余組織凍存?zhèn)溆?接種編號見表1)。每個(gè)標(biāo)本接種一只NCG小鼠,具體操作如下:NCG小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液,麻醉劑量為60 mg/kg,腹部備皮,碘伏消毒,沿腹中線稍偏右,開5~10 mm豎切口,用高溫滅菌后的棉簽,輕輕擠壓肝部,使其肝部曝露出體外,RPMI-1640培養(yǎng)基浸洗組織,去除結(jié)締組織和壞死組織,并將組織剪碎成小塊備用;選取合適的腫瘤組織1~2塊,吸入穿刺針;將穿刺針直接穿入肝小葉中,緩慢推出腫瘤組織塊,用棉簽輕微按住針口,緩慢拔出,完成接種。使用可吸收線縫合切口處1~2針,并在切口處滴一滴青霉素防止傷口感染,用經(jīng)高壓滅菌的紗布包裹手術(shù)部位,小鼠保溫,小鼠側(cè)放于新?lián)Q的籠具中,放入籠內(nèi)。術(shù)后3 d內(nèi)每天觀察小鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食、飲水及活動(dòng)情況,之后每周觀察記錄。

1.2.2 肝癌PDX模型皮下接種方法

接收新鮮組織,放入含20%FBS的4℃RPMI-1640培養(yǎng)基中,24 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)操作。于PBS緩沖液中將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊,去除結(jié)締組織和壞死組織(中間渣樣物),選取合適的腫瘤組織1~2塊,吸入穿刺針。每個(gè)標(biāo)本(接種編號見表1)接種1只NCG小鼠皮下組織(前肢腋下和后肢內(nèi)側(cè)),具體操作如下:1%戊巴比妥溶液腹腔注射受體小鼠,誘導(dǎo)并維持麻醉,小鼠取仰臥位,腹部皮膚備皮并消毒,眼科剪于腹正中橫向剪開皮膚約2 mm,形成進(jìn)針小口。將穿刺針從切口處進(jìn)入皮下,輕緩到達(dá)皮下上肢腋下,迅速推出組織塊,用鑷子輕摁穿刺針下部,旋轉(zhuǎn)拔出,完成接種;使用可吸收線縫合切口處1~2針,并在切口處滴一滴青霉素防止傷口感染,用經(jīng)高壓滅菌的紗布包裹手術(shù)部位,小鼠側(cè)放于新?lián)Q的籠具中。術(shù)后3 d內(nèi)每天觀察小鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食、飲水及活動(dòng)情況,之后每周觀察記錄。

表1 肝癌PDX模型患者信息Table 1 Clinical characteristics of orthotopic PDX models for hepatocellular carcinoma

1.2.3 核磁共振掃描肝癌原位腫瘤

接種原位肝細(xì)胞癌PDX模型小鼠在進(jìn)入掃描室前除去體內(nèi)或體表所有的金屬和鐵磁性物品(例如金屬耳號,芯片等),然后對小鼠通過異氟烷氣體(2%的異氟烷和O2混合氣體)麻醉,然后將小鼠放進(jìn)連通氣體麻醉劑的線圈內(nèi)固定。先將動(dòng)物床置于掃描架,并固定好,傳至掃描位置。動(dòng)物擺放俯臥姿,使頭正中矢狀面與身體長軸平行,身體中軸線與床板中軸重合,動(dòng)物門牙勾住固定裝置。通過調(diào)節(jié)掃描架位置,將掃描部位放置于磁場中心位置。T2WI對小鼠進(jìn)行橫斷面和矢狀面掃描,TR為2000~3000 ms,TE為48~84 ms,矩陣:256×256,ETL為8。在整個(gè)掃描過程中,小動(dòng)物的呼吸、心電和溫度等生理狀態(tài)需持續(xù)監(jiān)測。小動(dòng)物麻醉后體溫會降低,為防止體溫過低動(dòng)物死亡,MRI腔體內(nèi)需連接電熱水浴墊或使用熱風(fēng)持續(xù)加溫等方法維持動(dòng)物體溫。

1.2.4 腫瘤生長曲線測定

皮下移植的腫瘤,每7 d測量1次腫瘤的長徑(L)與短徑(W),計(jì)算腫瘤體積,腫瘤體積計(jì)算公式為V=1/2×(L×W2),繪制腫瘤生長曲線,當(dāng)腫瘤長徑達(dá)到1 cm時(shí)傳代或凍存。

1.2.5 腫瘤組織病理學(xué)檢查

MRI檢查后的原位肝癌模型和腫瘤長徑達(dá)到1 cm的皮下肝癌模型小鼠,通過頸椎脫臼法處安樂死,剝離肝上腫瘤組織,拍照記錄。然后取適量腫瘤組織于10%的中性甲醛溶液中固定至少24 h,通過梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,浸蠟包埋,待組織塊變硬后切片(4μm),貼于玻片上烘干;染色前使用二甲苯脫蠟,再經(jīng)梯度乙醇最后至蒸餾水中即可染色;染色時(shí)先在蘇木精中染色2 min,酸水和氨水中分色后,入酒精伊紅染色2 min,然后脫水封片。經(jīng)過HE染色的組織切片,在光鏡下觀察并掃描染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖片制作,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sˉx)表示,兩組間的數(shù)據(jù)采用Student’s t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)(超過20%的方格n<5時(shí),采用Fisher exact test)計(jì)算,P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建肝癌PDX原位和皮下模型

構(gòu)建肝癌原位PDX模型,模式圖如圖1A。術(shù)中出血少,無需止血,視野清楚。術(shù)后6 h內(nèi),精神欠佳活動(dòng)減少,能順利進(jìn)食;12 h后,精神狀態(tài)正常,能正?；顒?dòng)與進(jìn)食,小鼠術(shù)后均成活。構(gòu)建的肝癌皮下PDX模型,術(shù)中基本無出血狀況,無需止血。小鼠術(shù)后均成活。術(shù)后4 h內(nèi),精神欠佳活動(dòng)略少,能順利進(jìn)食,12 h后,精神狀態(tài)正常,能正常活動(dòng)與進(jìn)食。在肝癌PDX原位與皮下模型構(gòu)建過程中小鼠狀態(tài)良好,毛色光順、進(jìn)食進(jìn)水正常、糞便和尿量均無異常反應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)中有5例標(biāo)本同時(shí)構(gòu)建了肝原位和皮下的PDX模型,其中原位模型的LC30和LC31患者原位PDX模型分別在第43天和第23天在腹部肝部位觸摸到小軟包,似腫瘤生長,持續(xù)觀察記錄。LC30和LC31分別于73、42 d時(shí)通過核磁成像檢測,結(jié)果顯示,T2WI上呈現(xiàn)高信號,提示有腫瘤生長(圖1B)。解剖后發(fā)現(xiàn)腫瘤位置與MRI掃描圖一致(圖1C)。這5例肝癌PDX皮下模型中,LC31皮下模型建立成功,接種后18 d,開始可能觸摸到小芝麻粒樣的腫物,于35 d時(shí)腫物明顯。這例PDX模型通過游標(biāo)卡尺測量,統(tǒng)計(jì)其生長曲線,發(fā)現(xiàn)呈對數(shù)生長(圖1D)。

圖1 肝癌PDX原位和皮下模型的生長特征Note.A.Schematic diagram of HCC orthotopic and subcutaneous PDX model establishment.B.MRI results of the LC30 and LC31 HCC orthotopic PDX model at 73,42 d,respectively.C.Anatomy images of the LC30 and LC31 HCCorthotopic PDX model at 73,42 d,respectively.D.The growth curve of LC31 HCC subcutaneous PDX model.Figure 1 HCC orthotopic and subcutaneous PDX model growth characterization

2.2 肝癌PDX原位和皮下模型組織病理形態(tài)均與原始腫瘤相似

肝癌PDX模型成功荷瘤后,將肝癌患者腫瘤組織、PDX模型肝原位和皮下成瘤的組織,用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、組織切片后進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察成瘤前后腫瘤組織類型變化。結(jié)果顯示,LC30肝癌PDX模型肝原位法(P1)得到的腫瘤細(xì)胞呈巢團(tuán)狀排列,間質(zhì)較少,細(xì)胞異質(zhì)性明顯,核近圓形,不規(guī)則,核仁明顯,胞漿豐富,嗜酸性染色,形態(tài)同LC30患者(圖2A)。LC31肝癌PDX模型肝原位法(P1)腫瘤細(xì)胞彌漫性增生,細(xì)胞較小,大部分腫瘤呈篩狀生長方式(圖2A);LC31肝癌PDX模型皮下法(P1)細(xì)胞彌漫性增生,細(xì)胞較小,胞核較大,大部分腫瘤細(xì)胞排列較為整齊,呈篩狀生長方式(圖2B)。原位與皮下模型兩者與LC31患者原始腫瘤形態(tài)具有較高的相似性,表明原位與皮下成瘤均能較好的保持組織病理學(xué)特征。為了進(jìn)一步明確PDX模型中是否有癌旁組織和小鼠肝組織細(xì)胞,比較了人源和小鼠源的肝組織的形態(tài),發(fā)現(xiàn)兩者的細(xì)胞核圓形、較大,位于細(xì)胞中央,不同于PDX的P0和P1代腫瘤細(xì)胞形態(tài),表明建立的PDX模型來源于腫瘤組織而非癌旁部分(圖2C)。

圖2 肝癌PDX原位和皮下模型的組織病理形態(tài)Note.A.LC30 and LC31 HCCorthotopic PDX model,HE staining.B.LC31 HCC subcutaneous PDX model HE staining.C.Human and mouse liver HE staining.Figure 2 Histology of HCC orthotopic and subcutaneous PDX tumor tissues and human tumor tissues

2.3 肝癌PDX原位模型較皮下模型成瘤率高

PDX模型的成瘤率和成瘤周期是制約該模型應(yīng)用的兩個(gè)重要指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)配對5例原位模型中成瘤2例(編號為LC30和LC31,成瘤率40%),皮下成瘤1例(編號為LC31,成瘤率20%)兩者差異具有顯著性(圖3A);成瘤時(shí)間分別為:原位模型LC30:23 d,LC31:43 d;皮下成瘤LC31:35 d(圖3B)。由于本次實(shí)驗(yàn)數(shù)量較少,因此增加PDX模型(原位模型共6例,皮下模型共15例,編號見表1)綜合統(tǒng)計(jì)成瘤率,其中原位模型6例患者中3例成瘤,成功率為50%,皮下模型的15例患者中成功建模3例,成功率為20%(圖3C);原位腫瘤的平均成瘤時(shí)間為30 d,而皮下平均成瘤時(shí)間為68 d(圖3D)。綜上,原位PDX的成瘤率較皮下模型高100%~150%,成瘤時(shí)間比皮下模型相對短22.86%~126.67%(圖3)。

圖3 肝癌PDX原位和皮下模型的成瘤率與成瘤時(shí)間Note.A.The tumor formation rate in 5 paired HCC orthotopic and subcutaneous PDX model.B.The tumor formation time in LC31 HCC orthotopic and subcutaneous PDX model.C.The tumor formation rate in 6 HCC orthotopic and 15 subcutaneous PDX model.D.The tumor formation time in 6 HCC orthotopic and 15 subcutaneous PDX model.**P<0.01,****P<0.0001.Figure 3 Tumor formation rate and time in HCC orthotopic and subcutaneous PDX model

3 討論

肝細(xì)胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,是第二大致死性腫瘤,5年生存率約為18%,世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)到2030年會有將近1億的死亡病例[11]。目前肝癌的治療方法包括手術(shù)切除,腫瘤消融法,肝動(dòng)脈治療和系統(tǒng)性治療。對于早期肝癌患者(BCLC分期0或者A),手術(shù)和消融法是一線治療的首選方案。對于中期的肝癌(BCLC分期B)則考慮肝動(dòng)脈治療法。對于晚期進(jìn)展期肝癌患者(BCLC分期C)和部分中期患者則推薦以藥物為主的系統(tǒng)性治療[12]。肝癌進(jìn)展隱匿,早期癥狀不明顯,確診時(shí)大多為中晚期,需接受放療和化療在內(nèi)的綜合治療方案,其中化療以經(jīng)驗(yàn)性用藥為主。由于腫瘤患者的異質(zhì)性,個(gè)體差異較大,相同的病理診斷適用藥物不盡相同,臨床用藥有效性較低。

PDX模型是目前最接近臨床患者的藥物篩選模型,有望提供個(gè)體化的藥物策略,這些模型可以預(yù)測臨床結(jié)果,用于臨床前藥物評價(jià),并用于腫瘤的生物學(xué)研究,同時(shí)也是新藥研發(fā)的重要工具。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原位和皮下的PDX模型,通過組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)構(gòu)建原位和皮下PDX后,與原發(fā)灶的組織結(jié)構(gòu)和腫瘤類型十分接近。原位模型操作相對復(fù)雜,而且需要核磁等配套設(shè)備檢查成瘤情況。而皮下移植模型操作簡單,是沒有特殊要求和設(shè)備的情況下的常用模型構(gòu)建方法(見表2)。

表2 肝癌原位與皮下PDX模型比對Table 2 Compatative analysis of HCC orthotopic and subcutaneous PDX models

皮下模型由于腫瘤組織生長的微環(huán)境與生理狀態(tài)不同,而且血供營養(yǎng)較少,因此導(dǎo)致PDX移植失敗率高,并且生長緩慢。在PDX模型建立中P1代建模的成功率是“卡脖子”問題,本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的肝癌原位PDX成功率為50%,皮下PDX成功率約為20%,原位的成功率高于皮下成瘤率PDX模型,約2~3倍,且差異具有顯著性,這為難生長的腫瘤的模型建立提供一個(gè)較高生存幾率的建模方法;同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)原位模型平均成瘤時(shí)間為30 d,明顯腫瘤產(chǎn)生時(shí)間為68 d,平均成瘤縮短一半左右(見表2)。研究報(bào)道肝腫瘤細(xì)胞皮下P1代的平均成瘤時(shí)間為97 d,都長于原位PDX模型成瘤時(shí)間[9]。盡管目前還因?yàn)閿?shù)量比較少,bar值較高還沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在以后的實(shí)驗(yàn)中增加樣本量,預(yù)期獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的成瘤時(shí)間。

綜上,本次研究成功構(gòu)建肝癌原位和皮下PDX模型,肝癌原位PDX模型的高成瘤率為難生長腫瘤的建模提供了一個(gè)新方法,但皮下模型操作相對簡單,觀察方便。在具體科學(xué)實(shí)踐中根據(jù)需求具體選擇,例如:對于較難生長和樣本珍貴的腫瘤,優(yōu)先選擇原代接種;當(dāng)樣本易得,無特殊設(shè)備,或者數(shù)量較大時(shí)可選擇皮下模型造模;而且原位模型成瘤后傳代也可以考慮使用皮下模型。兩種模型為深入探索HCC的發(fā)病機(jī)制,及藥物篩選提供了有效的動(dòng)物模型。在本實(shí)驗(yàn)使用腫瘤組織塊構(gòu)建PDX模型,在實(shí)際應(yīng)用中還有胸腹腔積液,循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞等[13-14],這些模型構(gòu)建需要針對各自特點(diǎn)調(diào)整操作;本實(shí)驗(yàn)涉及的標(biāo)本均為原位肝癌,關(guān)于原位與皮下PDX模型在轉(zhuǎn)移瘤中的特點(diǎn)需要今后收集肝癌轉(zhuǎn)移病例驗(yàn)證;而且實(shí)驗(yàn)樣本量相對較少,在以后的科研實(shí)踐中需要增加肝癌患者樣本量,豐富原位和皮下PDX模型的構(gòu)建方法和效能評價(jià)數(shù)據(jù)。此外,原位和皮下PDX模型是將患者腫瘤組織接種在免疫缺陷小鼠身上,因此,破壞了腫瘤-免疫相互作用,如果在目前模型的基礎(chǔ)上,使用免疫系統(tǒng)人源化的小鼠模型,將會為研究人免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用提供有力模型工具[15]。