不同飼料模型下膳食脂肪對小鼠生理生化指標(biāo)的影響差異

李鑫,張琳玉,王湘林,劉翔燕,李曉文,王吉,文利新,2*,周迎芳,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院畜禽保健湖南省工程研究中心,長沙 410128;2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,長沙 410128;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院,長沙 410128)

隨著近年來超重、肥胖[1-3]、血脂異常[4]、糖尿病[5]等的發(fā)病率高速增長,營養(yǎng)代謝性疾病逐漸成為人們關(guān)注的焦點,油脂作為三大供能營養(yǎng)物質(zhì)之一,其攝入量與營養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)前以動物實驗探究膳食油脂種類對健康的影響時,因高脂(油脂供能40%以上)或富含膽固醇的飲食能縮短實驗周期,并且更顯著誘導(dǎo)機(jī)體病理變化[6-7],大多數(shù)研究均以高脂或添加膽固醇飼喂實驗動物從而得出不同油脂對健康的影響[8],但高脂高膽固醇飼料模型與居民日常飲食差別很大,因此很難準(zhǔn)確模擬人類正常膳食油脂攝入量對健康的影響。

豬油中飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFAs)含量豐富(約50%左右),其單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFAs)含量同樣達(dá)30%以上,橄欖油作為地中海飲食中典型的膳食用油,因富含極高的MUFA(超過70%),在西方被譽(yù)為“液體黃金”,我國是菜籽油最大的生產(chǎn)國、消費國,并且菜籽油是我國長江中下游地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)品[9],其成分也富含MUFA并且多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)也含量較高。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國營養(yǎng)學(xué)會建議,居民日常膳食總脂肪供能比例不宜超過30%,與居民越來越注重少油、少鹽飲食的現(xiàn)狀,本實驗以C57BL/6J雄性小鼠為研究對象,設(shè)置油脂供能水平為20%、30%,每個油脂供能水平的飼料油脂分別選擇4種油脂,即上述3種富含MUFA的代表油脂(豬油、菜籽油、橄欖油)和豬油與菜籽油的調(diào)和油(質(zhì)量比1∶1,簡稱調(diào)和油),研究在不同油脂攝入水平下該四種油脂對小鼠生長性能、脂肪沉積、血清生化指標(biāo)以及血糖的影響,探討膳食脂肪在不同的動物飼料模型下對實驗結(jié)果的影響,并為居民日常膳食中油脂的選擇與食用量提供更全面的實驗數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

120只SPF級雄性C57BL/6J小鼠,8周齡,體重18~22 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司【SCXK(湘)2016-0002】,飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗動物中心【SYXK(湘)2019-0017】,室溫控制到24~26℃,濕度為50%~60%,晝夜燈光控制周期為12 h,每周2次更換墊料,飼養(yǎng)過程自由采食及飲水。所有實驗步驟均通過了中國動物福利與使用指南的授權(quán),并通過了湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利委員會的授權(quán),項目審批代碼(43321820)。

1.1.2 主要試劑與儀器

膽固醇 (cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平、檢測試劑盒均購自江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司、胰島素購自諾和諾德(中國)制藥有限公司生產(chǎn)門冬胰島素注射液、羅氏血糖儀配套血糖試紙。

動物全自動生化分析儀DS-161V(江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司),安捷倫氣相色譜儀7890A、電子天平AUY120(日本島津公司)、羅氏血糖儀。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

小鼠以基礎(chǔ)日糧適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為8組,每組15只,分5籠,每籠3只,根據(jù)油脂供能水平設(shè)置油脂供能水平20%(低油脂供能水平)、30%(高油脂供能水平),每個油脂供能水平分別選用豬油(LA組)、菜籽油(RA組)、豬油菜籽油1∶1調(diào)和油(BO組)、橄欖油(OL組)飼喂小鼠,實驗周期共16周,每周末稱量小鼠空腹體重、計算采食量,第16周末禁食不禁水12 h后進(jìn)行采血、解剖等。

1.2.2 飼料油脂選擇及配方

飼料中豬油由采購自唐人神集團(tuán)股份有限公司的豬板油煉制所得,菜籽油購自道道全糧油股份有限公司的道道全醇香菜籽油,橄欖油購自WILMAR食用油私人有限公司的特級初榨橄欖油。飼料是由南通特洛菲飼料科技有限公司參照美國營養(yǎng)協(xié)會AIN93 M定制生產(chǎn)的純化飼料(見表1)。

表1 飼料成分表(g/kg)Table 1 Feed composition table(g/kg)

1.2.3 檢測方法

(1)油脂脂肪酸含量的測定:根據(jù)《食品中脂肪酸的測定》GB5009.168-2016的方法,用安捷倫氣相色譜儀7890A對油脂進(jìn)行脂肪酸含量檢測。

(2)樣品的采集:實驗結(jié)束后,小鼠麻醉后取血,取血后脫頸處死,解剖,取小鼠肝(除去膽囊)、腎、心臟、雙側(cè)附睪白色脂肪組織(除去附睪組織)和腎周白色脂肪組織稱重。將采集到的血液室溫靜置2 h后,4℃、3000 r/min離心10 min,取上清,-20℃待測。

(3)生長性能的監(jiān)測:實驗開始時,記錄每只小鼠的初體重,實驗過程中每周稱量小鼠空腹體重,計算每籠采食量,實驗結(jié)束后計算每只小鼠體重增長量、每籠飼料消耗量、計算每籠小鼠食物轉(zhuǎn)化率。

料肉比=每籠采食量g/每籠體重增長量g×100%

(4)體脂沉積的測定:實驗結(jié)束后測量小鼠體長(鼻到肛門的距離),稱量附睪白色脂肪和腎周白色脂肪重量計算腎周脂肪率、附睪脂肪率。

腎周脂肪率、附睪脂肪率=[附睪脂肪(g)或腎周脂肪(g)]/體重(g)×100%

Lee’s index=體重(g)^(1/3)×10/體長(mm)。

(5)器官指數(shù)的測定:臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)×100%。

(6)血液相關(guān)指標(biāo)的測定:按照儀器及試劑盒說明書檢測血清相關(guān)指標(biāo)。

(7)葡萄糖耐量試驗(glucose tolerance test,GTT)和胰島素耐量試驗(insulin tolerance test,ITT)以及終末血糖的測定:

腹腔注射葡萄糖耐量實驗(GTT):在實驗第8周末20:00將小鼠禁食不禁水12 h至次日8:00。每組隨機(jī)選定實驗小鼠7只,測定空腹血糖后,每克體腹腔注射0.05 mL濃度為40%葡萄糖溶液,測定每只小鼠注射后15、30、60、90 min血糖值并記錄。

腹腔注射葡萄糖耐量實驗(ITT):實驗第12周末8:00禁食不禁水6 h,每組隨機(jī)選定實驗小鼠7只,測定空腹血糖后,小鼠腹腔注射胰島素,注射劑量為0.5 U/kg,測定每只小鼠注射后15、30、60、90、120 min血糖值并記錄。

實驗第15周末晚20:00小鼠禁食不禁水12 h至次日早上8:00,測定其空腹血糖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗全部符合正態(tài)分布,采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示,數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊時組間采用LSD法,方差不齊時采用Tamhanes T2法。P<0.05為差異具有顯著性,P<0.01為差異極具顯著性,最后用GraphPad Prism 8軟件處理作圖。

2 結(jié)果

2.1 油脂中脂肪酸成分

油脂脂肪酸含量檢測結(jié)果如表2所示,豬油SFA∶MUFA∶PUFA為52.1∶35.8∶11.61,菜籽油SFA∶MUFA∶PUFA是7.2∶62.11∶30.02,橄欖油的SFA∶MUFA∶PUFA是14∶79.74∶6.29。由于豬油和菜籽油的復(fù)合油是按照1∶1進(jìn)行混合,所以其SFA∶MUFA∶PUFA約為29.65∶48.96∶20.82。

表2 油脂脂肪酸組成檢測Table 2 Detection of fatty acid composition

2.2 不同飼料模型下不同油脂對小鼠生長性能的影響

不同飼料模型下不同油脂對小鼠生長性能的影響如圖1所示,圖1A、1C小鼠初體重及采食量均顯著無差異,圖1B、1D可知20%油脂供能水平下,OL組相比于其他三組能顯著降低末體重,極顯著上升了料肉比。在30%油脂供能水平下,LA組相比于RA組顯著增加了末體重,相比于OL組極顯著增加了末體重,RA組、OL組相比于LA組、BO組極顯著上升了料肉比。以上結(jié)果表明:在低油脂供能水平下,橄欖油能降低小鼠末體重,提高料肉比。在高油脂供能水平下,菜籽油和橄欖油都能降低小鼠末體重,提高料肉比。

圖1 不同飼料模型下不同油脂對小鼠生長性能的影響Note.Under the same oil energy supply level,different letters indicated significant difference P<0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Effects of different lipids on the growth performance of mice under different feed models

2.3 不同飼料模型下不同油脂對小鼠Lee’s指數(shù)、體脂沉積的影響

不同飼料模型下不同油脂對小鼠Lee’s指數(shù)、體脂沉積的影響如圖2所示,20%油脂供能水平下RA組lee’s指數(shù)極顯著高于LA、OL組,在30%油脂供能水平下四種油脂lee’s指數(shù)無顯著差異,兩種油脂供能水平下腎周脂肪、附睪脂肪重與其相對脂肪率趨勢一致即在20%油脂供能水平下OL組極顯著低于其它三組,在30%油脂供能水平下RA、OL組極顯著低于LA組、BO組。以上結(jié)果表明,在低油脂供能水平下,菜籽油升高了Lee’s指數(shù),橄欖油能減少腎周脂肪、附睪脂肪的積累,在高攝入水平下,菜籽油與橄欖油都能減少腎周脂肪、附睪脂肪的積累。

圖2 不同飼料模型下不同油脂對小鼠Lee’s指數(shù)、體脂沉積的影響Figure 2 Effects of different lipids on Lee’s index and body fat deposition in mice under different feed models

2.4 不同飼料模型下不同油脂對小鼠肝、腎指數(shù)的影響

不同飼料模型下不同油脂對小鼠肝腎、指數(shù)的影響如圖3所示,圖3A、3B肝指數(shù)所示,兩種油脂供能水平下OL極顯著高于其它三組,圖3C、3D腎指數(shù)所示,在20%油脂供能水平下RA組顯著高于其它三組,在30%油脂供能水平下,LA、RA組顯著高于BO、OL組。以上結(jié)果表明,兩種供能水平下,橄欖油會升高肝指數(shù),菜籽油會升高腎指數(shù),在高攝入量下,豬油也會升高腎指數(shù)。

圖3 不同飼料模型下不同油脂對小鼠肝、腎指數(shù)的影響Figure 3 Influence of different lipids on liver and kidney indexes of mice under different feed models

2.5 不同飼料模型下不同油脂對小鼠血脂的影響

不同油脂對小鼠血脂的影響如圖4所示,圖4A血清TC含量檢測,在20%油脂供能水平下,LA組顯著高于其它三組。在30%油脂供能水平下,RA組顯著低于其它三組。圖4B血清TG含量檢測,在20%油脂供能水平下,RA組顯著高于其它3組,在30%油脂供能水平下,OL組血清TG含量最低。圖4C、4D血清HDL-C、LDL-C含量的檢測,LA組小鼠其血清HDL-C、LDL-C含量均較高,RA組與其相反,但從HDL-C/LDL-C比值來看,如圖4E所示,在20%油脂供能水平下RA組極顯著高于其它三組并在30%油脂供能時仍較高,而LA組和OL組在四種油脂供能水平下HDL-C/LDL-C比值均無顯著性差異。以上結(jié)果表明:兩種油脂供能水平下,菜籽油均可通過降低血清TC含量改善血脂,橄欖油可通過降低血清TG水平改善血脂。從血清HDL-C/LDL-C比值來看,豬油與橄欖油相比無差異,而菜籽油能升高其比值從而改善血脂。

圖4 不同飼料模型下不同油脂對小鼠血脂的影響Figure 4 Influence of different lipids on blood lipid in mice under different feed models

2.6 不同飼料模型下不同油脂對小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性的影響

不同油脂對小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性的影響如圖5所示,20%油脂供能水平下,圖5A葡萄糖耐量試驗(GTT)曲線下面積BO組顯著低于LA組、OL組,圖5B胰島素敏感性實驗(ITT)曲線下面積OL組顯著低于BO組。圖5C終末空腹血糖測定來看,20%油脂供能水平下四組小鼠無顯著性差異,但在油脂供能水平為30%時,BO組小鼠末血糖略有上升,但總體空腹血糖值都較低并未造成胰島素抵抗。以上結(jié)果表明:低油脂供能水平下豬油菜籽油1∶1調(diào)和油、橄欖油對血糖的調(diào)控更好,但本質(zhì)上兩種油脂供能水平下四種油脂均未造成小鼠血糖調(diào)控失衡。

圖5 不同飼料模型下不同油脂對小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性的影響Figure 5 Effects of different lipids on glucose tolerance and insulin sensitivity in mice under different feed models

3 討論

在居民日常膳食用油中,地中海飲食所提倡的橄欖油一直被人們推崇,有報道稱含有橄欖油、堅果等健康脂肪的飲食并不容易造成體質(zhì)量增加[10],一項薈萃分析的結(jié)果同樣指出,橄欖油飲食可以起到對體重控制的作用[11],在本研究中20%的油脂供能水平下,橄欖油確實體現(xiàn)了對體重的控制、減少了脂質(zhì)的積累。菜籽油同樣有助于減肥[12],在30%油脂供能水平下,菜籽油對體重、體脂的作用效果與橄欖油是一樣的,這表明在不超過高油脂供能水平的條件下菜籽油與橄欖油同樣可以起到對體重的調(diào)節(jié)。Lee’s指數(shù)與肥胖高度相關(guān),在20%油脂供能水平下,RA組lee’s指數(shù)最高,可能是其體長較短的原因。肝指數(shù)[13]、腎指數(shù)[14]可以反映臟器腫脹和炎性浸潤程度,結(jié)果表明,在20%、30%的油脂供能水平下,橄欖油均上升了肝指數(shù),并且在解剖過程中發(fā)現(xiàn)食用橄欖油的小鼠肝相較于其他組顏色蒼白,這說明橄欖油對肝功能可能產(chǎn)生了不利影響,這很可能造成20%、30%的油脂供能水平下食用橄欖油小鼠體重較輕的原因,在20%、30%的油脂供能水平下,食用菜籽油小鼠的腎指數(shù)顯著上升,可能是菜籽油中芥酸引起的,并且在30%的油脂供能水平下豬油也升高了腎指數(shù),這表明菜籽油或過高食用豬油可能對腎造成不利影響。

油脂中脂肪酸種類對機(jī)體健康也有所差異,研究表明,MUFAs(如油酸等)可以改善餐后血脂水平、改善胰島素抵抗等[15-16],PUFA中C18∶2n-6c(亞油酸)能降低血清LDL-C水平從而改善CVD[17],并且富含n-3 PUFAs的膳食油脂攝入能有效改善血脂、改善糖脂代謝[18-19]。從油脂組成成分結(jié)果來看,橄欖油中MUFA含量最高達(dá)79.74%,這可能是其降低小鼠血清TG含量的重要原因,菜籽油相比于其他油PUFA含量最多,其中C18∶2n-6c(亞油酸)占20.7%,n-3 PUFAs中C18∶3n-3(亞麻酸)占9.32%,并且這可能是在實驗中菜籽油降低血清TC含量并且其HDL-C/LDL-C值較其他油脂高的原因。

GTT、ITT、空腹血糖的測定反映了機(jī)體對血糖的調(diào)控能力,有實驗表明高脂條件下不同油脂對血糖的調(diào)控沒有本質(zhì)區(qū)別[20],在實驗中同樣發(fā)現(xiàn)兩種油脂供能水平下豬油、菜籽油、橄欖油對小鼠血糖調(diào)控、胰島素敏感性的影響一致。這表明膳食油脂可能并不是造成血糖紊亂、胰島細(xì)胞受損的唯一原因。

4 結(jié)論

本研究共構(gòu)建兩種動物飼料模型,每種模型下選用4種常見的膳食油脂,豬油、菜籽油、橄欖油、豬油菜籽油1∶1調(diào)和油,探討不同的動物飼料模型下不同油脂對實驗結(jié)果的影響,得出在30%油脂供能水平下豬油與豬油菜籽油1∶1調(diào)和油能增加小鼠體重和脂肪沉積,在20%、30%油脂供能水平下,橄欖油減少體重,減少了脂肪沉積,但可能對肝功能產(chǎn)生不利影響,菜籽油對血脂的改善最好,但其增加了腎指數(shù),四種油脂均未造成小鼠血糖調(diào)控能力受損。