小鼠模型脂肪組織中GIPR信號(hào)傳導(dǎo)在胰島素抵抗和肝脂肪變性中作用

楊晨,劉宇宏,楊慧玲

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院三二〇一醫(yī)院超聲科,陜西 漢中 723000;2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000;3.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710032)

肥胖會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗,其特點(diǎn)是空腹和餐后通過高胰島素血癥以維持血糖正常[1]。它是發(fā)展為2型糖尿病和心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[2-3]。減肥可以使高胰島素血癥正?；?并改善2型糖尿病和動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。

抑胃多肽/葡萄糖依賴性胰島素性多肽(GIP)是一種腸內(nèi)分泌K細(xì)胞消化后分泌的腸促胰島素并通過GIP受體(GIPR)增強(qiáng)胰島素分泌[4]。HFD誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌K細(xì)胞分泌GIP[5],有文獻(xiàn)指出,與正常脂肪飲食的老鼠相比,HFD的肥胖老鼠B細(xì)胞對(duì)GIP的反應(yīng)使胰島素分泌增加[6],這表明在HFD誘導(dǎo)的肥胖條件下,GIP在餐后高胰島素血癥中起關(guān)鍵作用。體外研究表明,GIP通過增加脂蛋白脂肪酶誘導(dǎo)脂肪組織的能量積累(LPL)通過CREB和CREB調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄共激活因子2(TORC2)介導(dǎo)途徑表達(dá),并通過akt介導(dǎo)途徑增加LPL酶活性和漿膜GLUT4表達(dá)[7]。因此,在HFD條件下,GIP和肥胖之間有很強(qiáng)的聯(lián)系[5]。GIPR敲除(GIPR-/-)小鼠,GIP拮抗劑和GIP免疫中和抑制GIPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可改善HFD喂養(yǎng)條件下的肥胖癥,提示該情況可能是由于缺乏對(duì)脂肪組織的直接和間接GIP作用[8-9]。但是,GIPR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)體內(nèi)脂肪組織的作用仍不清楚。

在本研究中,建立了GIPRadipo-/-小鼠,采用超聲評(píng)估脂肪組織中表達(dá)的GIP受體在體內(nèi)HFD誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗中是否起作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用小鼠B6N BAC克隆,構(gòu)建靶向載體。構(gòu)建的靶向載體注射到C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞中,建立Neo耐藥株。從轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交中獲得了GIPRfl/fl小鼠。通過GIPRfl/fl小鼠繁殖脂肪細(xì)胞蛋白2-Cre(Ap2-Cre)小鼠來(lái)建立雜合子小鼠(GIPRadipo+/-)。通過與GIPRadipo+/-小鼠雜交獲得純合(GIPRadipo-/-)小鼠。GIPRfl/fl小鼠用作野生型小鼠(WT)。清潔級(jí)GIPRadipo-/-和WT小鼠各16只,7周齡,體重約為20 g,來(lái)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(陜)2020-001】,飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室【SYXK(陜)2020-001】。各組小鼠飼喂CFD(能量中10%的脂肪)或HFD(能量中60%的脂肪),每組8只小鼠,持續(xù)15周。飼養(yǎng)環(huán)境:相對(duì)濕度約為50%,溫度控制在22~25℃,飼養(yǎng)于不銹鋼絲籠蓋,保持室內(nèi)空氣新鮮,氨濃度不超過20 ppm,換氣次數(shù)為每小時(shí)15次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的審批(審批號(hào):DW-HZ3201-005)。

1.1.2 主要試劑與儀器

TRIzol試劑(Invitrogen),PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa Bio),ELISA試劑盒:胰島素(Shibayagi),C肽(Shibayagi),總GIP(Shibayagi),脂聯(lián)素和瘦素(Millipore),白介素6(IL-6)(R&D Systems),LDLC、HDL-C、TG、NEFA檢測(cè)試劑盒(Sekisui Medical)。

實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(ABI,StepOnePlus,美國(guó)),BZ Analyzer軟件(KEYENCE Corp.,日本),GE B超掃描儀(GE Healthcare,Logiq P5,美國(guó)),圖像軟件(NIH,ImageJ 1.41o,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 PCR和微陣列芯片分析

使用TRIzol試劑提取總RNA,采用PrimeScript RT試劑盒將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。采用GAPDH或β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參對(duì)每個(gè)樣本中表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用8×60 K SurePrint G3基因表達(dá)微陣列芯片進(jìn)行分析。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

采用胰島素、C肽、總GIP、白介素6(IL-6)、脂聯(lián)素和瘦素ELISA試劑盒分別測(cè)量小鼠胰島素、C肽、總GIP、IL-6、脂聯(lián)素和瘦素的水平。1.2.3 口服葡萄糖、胰島素和丙酮酸耐量試驗(yàn)

禁食16 h后,進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試(OGTT)(1 g/kg體重)。通過葡萄糖氧化酶法測(cè)量血糖水平。計(jì)算了胰島素抵抗的HOMA(HOMAIR)。對(duì)于胰島素耐受性試驗(yàn)(ITT),禁食2 h后將人胰島素按0.75×體重(kg)的劑量對(duì)兩組小鼠進(jìn)行皮下注射。對(duì)于丙酮酸耐受性測(cè)試(PTT),禁食16 h后,將丙酮酸按1 g/kg體重劑量皮下注射到HFD喂養(yǎng)的小鼠中。

1.2.4 脂質(zhì)指標(biāo)

HFD喂養(yǎng)15周后,取小鼠空腹血漿標(biāo)本。通過LDL-C測(cè)定試劑盒、HDL-C檢測(cè)試劑盒、TG檢測(cè)試劑盒和非酯化脂肪酸(NEFA)檢測(cè)試劑盒測(cè)定LDL-C、HDL-C、甘油三酯(TG)和NEFA水平。提取肝脂質(zhì),并測(cè)量TG和總膽固醇水平。

1.2.5 超聲對(duì)肝重量和脂肪含量的定量測(cè)量

HFD喂養(yǎng)15周后,將小鼠用戊巴比妥麻醉,固定在小室內(nèi),由專業(yè)的超聲醫(yī)師對(duì)小鼠進(jìn)行肝超聲檢查,并使用NIH圖像軟件對(duì)肝體積、肝重量和肝中脂肪含量進(jìn)行定量評(píng)估[10]。

1.2.6 免疫組化

將肝和內(nèi)臟脂肪樣本固定在10%福爾馬林緩沖液中,包埋在石蠟中,切成3μm的切片。肝的石蠟切片用蘇木精和曙紅染色。采用具有BZ-8100系統(tǒng)的顯微鏡拍攝圖像。內(nèi)臟脂肪切片用3%BSA封閉,并在4°C下與兔抗perilipin-2單克隆抗體一起孵育過夜,然后在室溫下與二抗孵育1 h。免疫染色后,通過BZ Analyzer軟件分析脂肪細(xì)胞平均大小。

1.2.7 免疫印跡

將冷凍的組織提取物切碎并在緩沖液中進(jìn)行勻漿,然后12 377 r/min離心5 min,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡分析,采用了抗Akt和抗磷酸化Akt(Ser473)抗體進(jìn)行分析。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)和體外實(shí)驗(yàn)

為了研究了GIP對(duì)分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中IL-6表達(dá)影響。在10μg/mL胰島素,0.5μmol/L異丁基甲基黃嘌呤,2.5μmol/L地塞米松和10%FBS/DMEM中培養(yǎng)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞。在10%FBS/DMEM與10μg/mL胰島素中孵育2 d后,每2 d更換1次培養(yǎng)基。在分化的第9天,將3T3-L1脂肪細(xì)胞用100 nmol/L人GIP和2.5μmol/L二肽基肽酶4抑制劑K579預(yù)處理3 h,然后分別在5 ng/mL或10 ng/mL小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)條件下,用100 nmol/L人GIP和2.5μmol/L二肽基肽酶4抑制劑處理24 h,然后測(cè)定各組中IL-6表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件開展分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFD喂養(yǎng)條件下,脂肪組織中GIPR缺乏對(duì)體重,葡萄糖耐量和胰島素敏感性的影響

在CFD喂養(yǎng)條件下,WT和GIPRadipo-/-小鼠的體重增加無(wú)顯著性差異,兩組小鼠間血糖水平、胰島素水平、GIP總水平差異無(wú)顯著性。與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠的內(nèi)臟和皮下脂肪中GIPR mRNA的表達(dá)水平顯著降低了90%,兩組間GIPR mRNA在胰島,腦和十二指腸中的表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(見表1)。

表1 CFD喂養(yǎng)條件下,脂肪組織中GIPR缺乏對(duì)體重,葡萄糖耐量和胰島素的影響Table 1 Effect of GIPR deficiency in adipose tissue on body weight,glucose tolerance and insulin were observed under CFD-fed conditions

2.2 HFD喂養(yǎng)條件下脂肪組織中GIPR缺乏對(duì)體重,葡萄糖耐量和胰島素敏感性的影響

在HFD喂養(yǎng)下,GIPRadipo-/-小鼠的體重增加明顯低于WT小鼠(圖1A)。兩組之間的血糖和總GIP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠的C肽水平和胰島素水平顯著降低(P<0.05),但兩組之間的食物攝入量差異不顯著。此外,兩組之間的葡萄糖AUC、胰島素的AUC和GIP的AUC差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

GIPRadipo-/-小鼠的HOMA-IR值顯著低于WT小鼠(P<0.001)。ITT數(shù)據(jù)顯示,與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠的血糖水平顯著降低(P<0.001)。與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠PTT期間血糖水平顯著降低(P=0.009)(見表2)。此外,與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠的組織中Akt磷酸化都增加(見圖1B)。

表2 HFD喂養(yǎng)條件下,脂肪組織中GIPR缺乏對(duì)葡萄糖耐量和胰島素的影響Table 2 Effect of GIPR deficiency in adipose tissue on glucose tolerance and insulin under HFD-fed conditions

圖1 小鼠的體重變化及不同組織中的總Akt(P)和磷酸化-Akt(Ser473)結(jié)果Note.Compared with WT mice,**P<0.05,***P<0.01.Figure 1 Changes in body weight of mice and results of total Akt(P)and phosphorylated-Akt(Ser473)in different tissues

GIPRadipo-/-小鼠的空腹TG水平顯著低于WT小鼠。兩組之間的LDL-C,HDL-C和NEFA水平無(wú)顯著差異(見表3)。以上結(jié)果表明,在HFD條件下,脂肪組織中的GIPR缺乏會(huì)降低肝胰島素抵抗。

表3 HFD喂養(yǎng)WT和GIPRadipo-/-小鼠空腹血脂水平Table 3 Fasting plasma lipid levels in HFD-fed WT and GIPRadipo-/-mice

2.3 脂肪組織中的GIPR缺乏可減少HFD喂養(yǎng)小鼠的肝脂肪變性,但不能減少脂肪量

通過對(duì)perilipin-2進(jìn)行免疫染色來(lái)比較脂肪細(xì)胞的大小,兩組之間的脂肪細(xì)胞大小無(wú)顯著性差異(圖2A)。超聲結(jié)果顯示,GIPRadipo-/-小鼠肝體積、脂肪含量及肝重量顯著低于WT小鼠。肝的組織學(xué)分析表明,GIPRadipo-/-小鼠的脂滴大小和數(shù)量均比WT小鼠小(圖2B),此外,GIPRadipo-/-小鼠的肝中TG含量顯著低于WT小鼠,但總膽固醇含量差異無(wú)顯著性(見表4)。結(jié)果表明,在HFD喂養(yǎng)的條件下,脂肪組織中的GIPR缺乏可減輕肝脂肪變性。

表4 HFD喂養(yǎng)小鼠肝脂肪及膽固醇水平Table 4 Liver fat and cholesterol levels in HFD-fed WT and GIPRadipo-/-mice

圖2 小鼠皮下脂肪免疫組化及肝的蘇木精和曙紅染色結(jié)果(n=8)Figure 2 Immunohistochemical results of subcutaneous fat and hematoxylin and eosin staining results of liver in mice(n=8)

2.4 GIPR缺乏抑制脂肪組織中HFD誘導(dǎo)的IL-6 mRNA表達(dá)

兩組在HFD喂養(yǎng)的條件下,TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)和IL-1βmRNA的表達(dá)水平?jīng)]有差異。HFD喂養(yǎng)的GIPRadipo-/-小鼠的IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著低于WT小鼠。在HFD喂養(yǎng)的條件下,兩組之間的血漿脂聯(lián)素和瘦素水平也無(wú)顯著性差異(見表5)。

表5 HFD喂養(yǎng)條件下相關(guān)炎性細(xì)胞因子相對(duì)mRNA表達(dá)水平(n=8)Table 5 Relative mRNA expression levels of related inflammatory cytokines under HFD-fed conditions(n=8)

此外研究了GIP對(duì)分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中IL-6表達(dá)影響。IL-6 mRNA表達(dá)沒有被GIP刺激所增強(qiáng)(圖3A)。GIP處理后,細(xì)胞中IL-6水平顯著增加,但I(xiàn)L-6水平的增加非常小(圖3B)。然而,GIP顯著增強(qiáng)了IL-6 mRNA表達(dá)(圖3C)和IL-6產(chǎn)生(圖3D)在存在TNF-α的3T3-L1脂肪細(xì)胞中,表明GIP增強(qiáng)了TNF-α誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞中IL-6的表達(dá)和產(chǎn)生。

圖3 在存在或不存在TNF-α的情況下,經(jīng)GIP(100 nmol/L)處理24 h的3T3-L1脂肪細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平和血漿IL-6水平Note.Compared with untreated groups,*P<0.05,**P<0.05.Compared with GIP treatment groups in the prescience of 5 ng/mL TNF-α,#P<0.05,###P<0.001.Figure 3 IL-6 mRNA expression levels and plasma IL-6 levels in 3T3-L1 adipocytes treated with GIP(100 nmol/L)for 24 h with or without TNF-α

3 討論

本研究采用超聲評(píng)估了GIP在GIPRadipo-/-小鼠體內(nèi)脂肪組織中的直接作用。與HFD喂養(yǎng)的WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠表現(xiàn)出更低的體重,胰島素抵抗降低和改善肝脂肪變性。

盡管食物攝入,能量消耗方面的差異不明顯,但GIPRadipo-/-小鼠的體重增加明顯低于WT小鼠。這種作用可能是由于GIPRadipo-/-小鼠從腸道吸收的卡路里減少或用于檢測(cè)小鼠之間體重差異的方法存在一定局限性。此外,超聲分析發(fā)現(xiàn)和WT小鼠比,GIPRadipo-/-小鼠肝重量、脂肪含量及肝體積下降。在HFD喂養(yǎng)的條件下,與WT小鼠相比,GIPRadipo-/-小鼠肝重量減少對(duì)總體體重減輕的貢獻(xiàn)約為45%,說明體重的降低部分是由于GIPRadipo-/-小鼠肝重量的減少。已有研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組GIPR-/-小鼠相比,具有Ap2啟動(dòng)子-GIPR轉(zhuǎn)基因的GIPR-/-小鼠體重增加,這不是由于脂肪量的增加而是瘦肉質(zhì)量的增加[11]。

脂肪組織中由GIPR信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子可能與HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝脂肪變性有關(guān),因?yàn)樵谟蒆FD喂養(yǎng)的GIPRadipo-/-小鼠中胰島素抵抗和肝脂肪變性降低。對(duì)脂肪組織的微陣列分析顯示,在GIPRadipo-/-小鼠的脂肪組織中,IL-6的表達(dá)降低。IL-6參與炎癥和代謝過程的調(diào)節(jié),IL-6的循環(huán)水平與肥胖呈正相關(guān),脂肪來(lái)源的IL-6在誘導(dǎo)胰島素抵抗和肝脂肪變性中起關(guān)鍵作用[12-13]。已有體外研究報(bào)道了GIP直接增加脂肪組織IL-6的表達(dá)水平[14],GIP還可激活脂肪組織中的CREB[15]。本研究結(jié)果表明TNF-α以劑量依賴的方式顯著提高了GIP誘導(dǎo)的IL-6表達(dá),表明在脂肪組織存在的情況下,GIP可以增強(qiáng)脂肪組織中IL-6 mRNA的表達(dá)。

有文獻(xiàn)指出,在人脂肪細(xì)胞中存在TNF-α的情況下,GIP誘導(dǎo)IL-6 mRNA表達(dá)并增強(qiáng)IL-6分泌[15]。與此一致,本研究在喂食HFD的GIPRadipo-/-小鼠的脂肪細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)降低。因此,GIPRadipo-/-小鼠可能有助于研究GIPR在體內(nèi)脂肪組織中表達(dá)的GIPR在肥胖和胰島素抵抗中的作用。這些數(shù)據(jù)表明,在HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝脂肪變性的治療中,GIP信號(hào)的抑制可能具有作為治療靶標(biāo)的潛力。

總之,在體內(nèi),脂肪組織中的GIPR信號(hào)傳導(dǎo)在HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝脂肪變性中起重要作用,這可能涉及IL-6信號(hào)傳導(dǎo)。