Alu基因定量檢測用于胃癌轉(zhuǎn)移模型評估的研究

吳朋朋,柳森森,張彩勤,趙勇,白冰,王潔,師長宏*

(1.空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心,西安 710032;2.空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,西安 710032)

Alu家族是一種僅存在于靈長類基因組中的散布重復序列,可用于檢測各種遺傳改變[1]。1989年,Nelson等[2]首先提出Alu-PCR技術(shù),用于不同種屬的遺傳多態(tài)性分析(Alu重復序列之間堿基序列的插入,缺失,易位和引發(fā)位點的突變等),且能夠顯示個體間的差異。Alu-PCR是一種非常敏感的檢測方法,能夠從大量鼠類組織樣品中準確靈敏地檢測出人的腫瘤細胞,甚至可以從石蠟包埋組織切片提取的DNA中檢測出Alu重復序列[3],從而量化腫瘤細胞[4]。Schneider等[5]采用了更加靈敏的實時熒光定量PCR方法,重新設(shè)計了針對人Alu序列的特異性定量引物,發(fā)現(xiàn)可以從相當于1×106個小鼠細胞中檢測出一個人類腫瘤細胞,適合于擴增不同腫瘤細胞中的Alu序列。這說明Alu序列的物種特異性和高度重復性可用于人類基因組DNA的敏感定量分析。

胃癌(gastric cancer,GC)是全世界最常見的惡性腫瘤,在中國癌癥致死的相關(guān)病例中,胃癌排在首位[6]。盡管胃癌在手術(shù)和其他輔助治療上取得了不錯的進展,其侵襲和易轉(zhuǎn)移的特性使得多數(shù)患者診時就已達到中晚期,甚至出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移,極大的影響了治療效果,使患者的生存質(zhì)量降低。胃癌早期轉(zhuǎn)移的發(fā)生無法預測,且胃癌轉(zhuǎn)移標本采集困難,僅僅依據(jù)臨床表現(xiàn)、手術(shù)及用藥效果來評價胃癌預后已很難滿足治療腫瘤的需求[7-8]。

胃癌的異種移植模型能夠模擬人胃癌在體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等一系列生物學特性,是研究胃癌的一個重要工具[9]。本課題組前期將臨床胃癌患者新鮮的手術(shù)標本移植到裸鼠體內(nèi)成功建立了人胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型(patient derived xenograft,PDX),不僅形成移植瘤,而且成功檢測到了肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移病灶,該模型為臨床胃癌的轉(zhuǎn)移研究提供了有效的個體化轉(zhuǎn)移模型[10]。由于Alu序列特異性存在于人類組織中,當小鼠組織中有人類腫瘤細胞所形成的轉(zhuǎn)移灶,則可通過RT-PCR檢測人Alu基因序列的表達來評估腫瘤在小鼠組織臟器的轉(zhuǎn)移程度[11]。因此,本研究通過設(shè)計人Alu基因特異性引物,經(jīng)RT-PCR檢測不同胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型各組織人Alu基因的表達,分析其與裸鼠各組織胃癌細胞轉(zhuǎn)移程度的關(guān)系,為評估胃癌轉(zhuǎn)移模型中各組織胃癌轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移程度,以及胃癌轉(zhuǎn)移動物模型的評估提供有效的分子生物學方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

60只6~7周齡SPF級雄性裸鼠,體重22~25 g,購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】,飼養(yǎng)在中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(陜)2019-001】。環(huán)境溫度20~26℃,相對濕度40%~70%,12 h光照/12 h黑暗,飼料經(jīng)輻照處理,飲用水經(jīng)高壓滅菌處理,實驗鼠自由攝食和飲水。動物實驗通過了空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利及倫理委員會批準(審批號:20180512)。

1.1.2 細胞及腫瘤樣本

人胃癌細胞SGC-7901、MKN45及人正常胃黏膜細胞GES1購買于國家實驗細胞資源共享平臺,小鼠成纖維細胞(L929)為本實驗室保存。細胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素),37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

臨床胃癌標本來自空軍軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院,腫瘤標本的取得經(jīng)過患者本人及家屬同意,并簽署知情同意書,相應實驗通過西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(審批號:2015432)。

1.1.3 主要試劑與儀器

基質(zhì)膠(Matrigel Matrix)由美國BD公司生產(chǎn);異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基和0.05%胰酶購自美國HyClone公司;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;蘇木精和伊紅染色液購自北京Leagene生物技術(shù)有限公司;基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒DNA提取試劑盒購買于北京天根生化科技有限公司;熒光定量PCR及質(zhì)粒構(gòu)建等分子生物相關(guān)試劑均購自大連寶生物工程有限公司。酶標儀(Biotek Take,美國);基因擴增儀(eppendorf,德國);熒光定量PCR儀(StepOne Plus,Thermo Fisher,美國)等。

1.2 方法

1.2.1 Alu基因擴增及標準質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI人類基因組DNA中的Alu基因(XR_948994)序列以及相關(guān)文獻[12-13],設(shè)計并合成特異性引物(表1),提取人胃癌細胞SGC-7901、MKN45和正常胃黏膜細胞GES1基因組DNA,按PrimeSTAR? HS DNA Polymerase操作說明,PCR擴增Alu基因(Alu865引物)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后,用DNA回收試劑盒回收目的基因(865 bp)并克隆至pMD19-T載體中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109。轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后,由寶生物工程(大連)有限公司用pMD18-R測序引物進行測序。

表1 引物序列信息Table 1 Information of the primer sequences

1.2.2 繪制Alu基因表達標準曲線

將Alu基因標準質(zhì)粒梯度稀釋為不同濃度(50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032 ng/μL),去離子水為陰性對照組(NTC),按SYBR? Premix Ex TaqTMII操作說明進行Alu基因的定量檢測(Alu引物)。每組樣本檢測3次,每次檢測均做3個復孔,最終Ct值以平均數(shù)表示(以下Ct值均相同),根據(jù)拷貝數(shù)計算公式計算待測樣本中Alu基因的拷貝數(shù)[14]。

Alu基因拷貝數(shù)(copies/μL)=[質(zhì)粒濃度(ng/μL)×1μL]×10-9×(6.02×1023copies/mol)/[(質(zhì)粒分子量+插入片段分子量)×660]

1.2.3 不同比例胃癌腫瘤細胞(SGC-7901)中Alu基因的檢測

在小鼠成纖維細胞(L929)懸液中混合胃癌腫瘤細胞(SGC-7901),使得L929細胞中SGC-7901細胞的百分比分別達到0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。提取各組的基因組DNA,測定每組Alu基因的Ct值并繪制標準曲線。

1.2.4 胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型的制備及人Alu基因的檢測

選取SGC-7901和MKN45胃癌細胞,分別用無菌PBS將細胞稀釋成1×107/0.2 mL細胞懸液接種到10只6~8周齡的裸鼠皮下,繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。每周測量1次腫瘤體積,腫瘤體積計算公式采用V=1/2×l×w2,其中l(wèi)為腫瘤最長直徑,w為腫瘤最短直徑。腫瘤生長至約1000 mm3,將模型鼠安樂死后采集每只裸鼠的肝、脾、肺、腎和皮下腫瘤組織,取部分樣本用4%多聚甲醛固定,用于病理切片染色觀察和腫瘤相關(guān)標志物免疫組化檢測;部分樣本提取基因組DNA進行人Alu基因的測定。

1.2.5 Alu基因檢測評估人胃癌病人異種移植模型轉(zhuǎn)移趨勢

將采集的3例臨床胃癌患者新鮮腫瘤標本(C26284、C72448和C61262)用剪刀修整為直徑1 mm左右的組織塊,與基質(zhì)膠1∶1混勻后用套管針注射于6~8周齡的裸鼠皮下,傷口消毒后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。同時裸鼠尾靜脈注射胃癌細胞(SGC-7901)作為胃癌轉(zhuǎn)移模型陽性對照組,正常裸鼠作為陰性對照組。待腫瘤生長至1000 mm3后,模型鼠進行安樂死,采集裸鼠肝、脾、肺、腎和皮下腫瘤,取部分樣本組織用4%多聚甲醛固定,用于病理切片染色觀察;部分組織提取基因組DNA,用于人Alu基因的檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異具有顯著性,P<0.01為差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Alu基因擴增及標準質(zhì)粒的構(gòu)建

以人胃癌細胞基因組DNA為模板構(gòu)建的Alu基因標準質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定和Alu基因序列測序,結(jié)果與NCBI的Alu序列完全相符(見圖1),說明了本研究設(shè)計的Alu引物具有較好的特異性且Alu基因廣泛存在于人胃癌細胞及腫瘤組織中。

圖1 各細胞系中Alu基因的擴增Note.M.DL2000 DNA Marker.1.Genomic DNA of mouse.2.SGC-7901.3.MKN45.4.GES1.5.Genomic DNA of gastric cancer tumors.6.Negative control.Figure 1 PCR amplification of Alu gene in the gastric cancer cell lines

2.2 Alu基因標準曲線的繪制

實時定量PCR檢測不同濃度質(zhì)粒Alu基因的Ct值繪制標準曲線,并根據(jù)拷貝數(shù)計算公式計算待測樣本中Alu基因的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,Alu基因的Ct值與其拷貝數(shù)呈負線性相關(guān)(R2=0.9979),即Alu基因的Ct值越低,其拷貝數(shù)越高(見圖2、表2)。

表2 不同濃度標準質(zhì)粒Alu基因的表達Table 2 Alu gene expression in different concentration of Alu plasmids

圖2 Alu基因標準曲線Figure 2 Standard curve of Alu

2.3 不同比例胃癌細胞(SGC-7901)中Alu基因的檢測

梯度調(diào)整小鼠成纖維細胞(L929)懸液中胃癌細胞(SGC-7901)的百分比,測定每組人Alu基因的表達情況并繪制標準曲線。結(jié)果顯示(圖3,表3)Alu基因的Ct值與胃癌細胞(SGC-7901)的百分比呈負相關(guān)(R2=0.9239),即細胞混合液中胃癌細胞含量越低,Alu基因的拷貝數(shù)越低,Alu基因的Ct值越高。

表3 不同濃度SGC-7901細胞中Alu基因的表達Table 3 Expression of Alu in different concentrations of SGC-7901

圖3 SGC-7901細胞Alu基因表達標準曲線Figure 3 Standard curve of Alu in SGC-7901

2.4 人胃癌異種移植轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建及Alu基因的檢測

將胃癌細胞(SGC-7901和MKN45)構(gòu)建的CDX模型鼠安樂死并解剖觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠除皮下形成明顯的腫瘤外,肉眼可看到部分裸鼠在肝、肺部有腫瘤轉(zhuǎn)移灶(圖4 MKN45和SGC-7901細胞模型組左側(cè)圖)。用臨床獲得的新鮮胃癌手術(shù)標本構(gòu)建的PDX模型(C26284、C72448和C61262)也發(fā)現(xiàn)了肺和肝部轉(zhuǎn)移灶(圖4 C26284、C72448和C61262病人腫瘤模型組左側(cè)圖)。HE染色觀察(圖4各模型組右側(cè)圖)可見肺和肝組織中有明顯的腫瘤侵入形態(tài)結(jié)構(gòu),腫瘤組織腺體生長豐富,腫瘤細胞處于增殖旺盛階段,符合胃腺癌的特征。病理結(jié)果均顯示裸鼠組織中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)腫瘤保持了相同的組織結(jié)構(gòu)。

圖4 胃癌小鼠模型轉(zhuǎn)移瘤的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)Note.Left side of each group is the metastatic tumor morphology,right side is the HE staining result of metastatic organ tissue.Figure 4 Morphology and tissue structure of metastatic tumor

進一步檢測胃癌細胞(SGC-7901和MKN45)構(gòu)建的CDX模型鼠肝、脾、肺、腎及皮下腫瘤組織中的人Alu基因表達,正常未接種腫瘤的裸鼠作為陰性對照(表4)。結(jié)果顯示SGC-7901組人Alu基因高表達主要發(fā)生在肺(Ct值13.88);MKN45組則主要發(fā)生在肝(Ct值13.21)和肺(Ct值16.61),而其他組織臟器人Alu基因Ct值均大于17(脾,Ct值17.86;腎,Ct值17.93),這與組織學檢查和解剖觀察的臟器轉(zhuǎn)移結(jié)果相符。

表4 不同小鼠器官人Alu基因的表達Table 4 Expression of Alu gene in different mice organs

將各樣本按器官來源重新分組,結(jié)果顯示(圖5):胃癌細胞Alu基因的Ct值為4.56~8.50;皮下腫瘤為7.21~9.92;肺轉(zhuǎn)移瘤為13.88~17.93;肝轉(zhuǎn)移瘤為12.61~17.86;裸鼠各臟器組織Ct值為20.67~23.66;陰性對照為26.66~27.66。說明人Alu基因的表達在胃癌細胞和腫瘤細胞豐富的皮下腫瘤中處于較高水平;在正常裸鼠各臟器組織中表達最低;發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的肺和肝中人Alu基因的表達則介于正常裸鼠與皮下腫瘤之間,這也與組織病理學檢查結(jié)果相符。

圖5 不同組織樣本人Alu基因的表達Figure 5 Expression of Alu gene in different sources tissues

2.5 人Alu基因檢測評估胃癌病人異種移植模型轉(zhuǎn)移趨勢

收集胃癌病人異種移植模型鼠的肝、脾、肺、腎及皮下腫瘤組織并檢測人Alu基因的表達,結(jié)果顯示(表5、圖6):SGC-7901組轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肺(Ct值11.85);C61262組轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝(Ct值13.88)和肺(Ct值14.28);C26284組轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肺(Ct值15.74);C72448組轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝(Ct值13.02)和腎(Ct值13.69),這與組織學檢查和解剖觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝和肺部結(jié)果相符。

圖6 不同胃癌轉(zhuǎn)移模型小鼠組織中人Alu基因的表達Figure 6 Expression of Alu gene in gastric cancer metastatic mice organs

表5 胃癌轉(zhuǎn)移小鼠各器官人Alu基因的表達Table 5 Expression of Alu gene in gastric cancer metastatic mice organs

選取組織學檢查中已經(jīng)明確發(fā)現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移細胞的組織樣本(HE染色和胃癌腫瘤相關(guān)標志物CEA、CA19-9均為陽性),按照解剖中能否發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶重新分組,結(jié)果顯示(見圖7):相比于皮下腫瘤組織(Ct值9.29),未形成轉(zhuǎn)移灶的組織(Ct值17.86)與健康裸鼠組織(Ct值22.18)差異顯著(P<0.05),而形成轉(zhuǎn)移灶的組織(Ct值14.29)差異極顯著(P<0.01)。進一步說明了人Alu基因的表達與胃癌轉(zhuǎn)移模型各組織胃癌轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān),Alu基因表達越高(Ct值越低),該組織中轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞就越多,形成的腫瘤轉(zhuǎn)移灶越明顯。

圖7 不同轉(zhuǎn)移程度組織樣本Alu基因的表達Figure 7 Expression of Alu gene in different metastasis tissues

3 討論

本課題組先后用人胃癌細胞SGC-7901和MKN45建立了細胞系移植(CDX)模型,用胃癌臨床手術(shù)標本獲得的3例PDX模型(C26284、C72448和C61262),經(jīng)過多次傳代篩選后該模型發(fā)生了肺部和肝部轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移灶病理切片的HE染色確定符合胃腺癌的特征。

Funakoshi等[15]開發(fā)了一種基于Alu的高靈敏度和特異性的實時PCR方法,用于區(qū)分人類細胞和嚙齒動物細胞,可以從100 ng的人類和嚙齒動物混合基因組DNA中檢測到1個fg的人Alu基因,相當于1億個嚙齒動物細胞中有1個人類細胞。而Schneider等[5]也發(fā)現(xiàn)在人類異種移植的106個小鼠血細胞中可以很容易地檢測到一個人類癌細胞。Nehmann等[16]在比較了Alu實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)和激光掃描細胞術(shù)(LSC)兩種方法檢測小鼠外周血中人HT29結(jié)腸癌細胞的有效性時發(fā)現(xiàn),無論加入多少癌細胞,使用qRT-PCR在所有樣本中都能正確地檢測出小鼠血液中幾乎100%的人類癌細胞數(shù)量,也進一步確認了通過PCR檢測人Alu基因的表達來直接監(jiān)測轉(zhuǎn)移部位的腫瘤負荷的可行性。

本研究就是在Schneider等[5]方法的基礎(chǔ)上,重新設(shè)計人Alu基因特異性引物序列,通過實時定量PCR特異性檢測胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型各組織中人Alu基因的表達。為了確定精確測定Alu基因的拷貝數(shù),以人胃癌細胞基因組DNA為模板構(gòu)建了Alu基因標準質(zhì)粒,RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)Alu基因的拷貝數(shù)隨著各組中標準質(zhì)粒濃度的增加而增加(R2=0.99),即Alu基因的Ct值越低,其拷貝數(shù)則越高。同時,隨著小鼠成纖維細胞(L929)中胃癌腫瘤細胞(SGC-7901)含量的增加人Alu基因的表達也呈逐步上升的現(xiàn)象(R2=0.92),這與Zubair等[17]在小鼠的脾、肺和肝中檢測到注射的人淋巴瘤細胞的研究結(jié)果相符。也說明了細胞混合液中胃癌細胞含量越低,人Alu基因的拷貝數(shù)也越低。

在建立的人胃癌細胞異種移植轉(zhuǎn)移模型鼠(SGC-7901和MKN45)各個臟器中,人Alu基因在胃癌細胞(Ct值為4.56~8.50)和腫瘤細胞豐富的皮下腫瘤(Ct值為7.21~9.92)均處于較高的表達水平,在正常裸鼠各臟器組織中表達最低;而在肺轉(zhuǎn)移瘤(Ct值為13.88~17.93)和肝轉(zhuǎn)移瘤(Ct值為12.61~17.86)中人Alu基因表達則處于正常裸鼠和皮下腫瘤兩者之間,不僅與組織學檢查(HE染色)結(jié)果相符,而且與Schneider等[5]發(fā)現(xiàn)“在攜帶腫瘤的小鼠中,Alu信號隨著時間的推移在轉(zhuǎn)移器官中逐步增加,且在高轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中,這種增加更為明顯”的結(jié)果相一致。

通過PDX模型進一步確認了上述規(guī)律,而且發(fā)現(xiàn)病理學分析已明確發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織樣本中,雖然未形成肉眼可見轉(zhuǎn)移灶,但其Ct值(17.86)與正常裸鼠組織Ct值(22.18)具有顯著差異性(P<0.05),而肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶中Ct值(均值為14.29),則差異極具顯著性(P<0.01)。這說明在準確判定轉(zhuǎn)移的前提下(與組織學檢查結(jié)果一致),該方法不僅能夠檢測腫瘤細胞豐富的組織樣本(皮下腫瘤組織,肉眼可見轉(zhuǎn)移灶的組織),也能夠有效的從發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織中區(qū)分早期轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞,進一步驗證了該方法具有極高的靈敏度,也證明了人Alu基因的表達與轉(zhuǎn)移部位的腫瘤負荷呈線性相關(guān)。這也與Lange等[18]在PDX腫瘤傳代中發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移,檢測到小鼠血液、肺和肝中腫瘤細胞的數(shù)量與轉(zhuǎn)移進展直接相關(guān),但在骨髓或腦中觀察不到這種相關(guān)性的結(jié)果相一致。當然,由于目前基于臨床胃癌病人的PDX轉(zhuǎn)移模數(shù)量型有限,還不能精確確定胃癌轉(zhuǎn)移模型鼠發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的組織與未發(fā)生轉(zhuǎn)移組織人Alu基因的Ct值界限,本實驗室將會深入細致研究人Alu基因檢測在胃癌轉(zhuǎn)移模型轉(zhuǎn)移程度預測中的應用。

綜上所述,通過熒光定量PCR檢測了人胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型中各組織人Alu基因的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人Alu基因表達越高,組織中轉(zhuǎn)移的胃癌腫瘤細胞越多,轉(zhuǎn)移灶越明顯。本研究為評估胃癌轉(zhuǎn)移模型中各組織胃癌轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移程度,以及胃癌轉(zhuǎn)移動物模型的評估提供可靠的分子生物學參考方法。