補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥FoxO1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平的影響

孟鑫,李穎,張宇,曹璨,白羽,陳景偉

(河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,中西醫(yī)結(jié)合研究所,河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050200)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥,是一種常見的具有侵襲性的婦科疾病,指在宮腔以外的部位出現(xiàn)子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì)),并于該處不斷生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、反復(fù)出血而引起的一種慢性病變[1]。臨床上主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、月經(jīng)失調(diào)及不孕等,發(fā)病率高達(dá)5%~10%,并呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),嚴(yán)重影響著患者的精神及生活質(zhì)量[2]。EMs的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及多種因素與機(jī)制,但尚無(wú)定論。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬水平異常與EMs的發(fā)生存在著密切關(guān)系。細(xì)胞自噬的發(fā)生是一個(gè)多因素調(diào)節(jié)的過(guò)程,其水平受到多條信號(hào)通路的調(diào)控[3]。近年叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead transcription factors O1,FoxO1)在自噬調(diào)節(jié)中的作用倍受關(guān)注。FoxO1是FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族中重要的一員,是一類關(guān)鍵的自噬調(diào)控因子,已被證實(shí)在細(xì)胞周期進(jìn)展和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]。核因子KappaB(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的重要轉(zhuǎn)錄因子,激活NF-κB可誘導(dǎo)多種炎性因子、抗細(xì)胞凋亡因子等的釋放,介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞自噬,是多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑,廣泛參與機(jī)體炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過(guò)程,從而促進(jìn)EMs的發(fā)生發(fā)展[5]。

目前,EMs的西醫(yī)治療主要以手術(shù)與藥物為主,且存在治療不徹底及術(shù)后復(fù)發(fā)率高的局限性[6],缺乏理想的治療效果。中醫(yī)認(rèn)為EMs的病機(jī)之本為腎陽(yáng)虧虛,瘀血阻滯[7],補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方具有補(bǔ)腎溫陽(yáng),祛瘀止痛的功效,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀型EMs大鼠模型FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子水平的影響,從細(xì)胞自噬的角度探究補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療EMs的作用機(jī)制,為補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

100只SPF級(jí)雌性SD大鼠,8~10周齡,體重200~250 g;購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及后續(xù)觀察于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心進(jìn)行【SYXK(冀)2017-005】,期間給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由飲水,室溫(23±2)℃,光照明暗各12 h,通風(fēng)良好,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有操作均符合河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的相關(guān)倫理審批(編號(hào):DWLL2020031)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方(組成:肉桂、制附子、小茴香、川牛膝、吳茱萸、狗脊、桑寄生、延胡索等)免煎顆粒劑,統(tǒng)一購(gòu)自神威藥業(yè);孕三烯酮膠囊,每粒2.5 mg(北京紫竹藥業(yè)有限公司,批號(hào):53190501);戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂)(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批號(hào):469A);異氟烷(100 mL,批號(hào):201805);硫酸慶大霉素注射液(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,批號(hào):068180408)。

1.1.3 主要試劑與儀器

FoxO1A抗體(abcam公司,批號(hào):ab39670);NFκB p65抗體(abcam公司,批號(hào):ab16502);LC3B抗體(Sigma公司,批號(hào):049M4783V);Beclin-1抗體(abcam公司,批號(hào):ab210498);GAPDH(Servicebio公司,批號(hào):P04406);HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Servicebio公司,批號(hào):GB23303)。

小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國(guó)MIDMARK公司,品牌及型號(hào):MATRX,VMR);電子測(cè)痛儀(品牌及型號(hào):Model 2391);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD,型號(hào):CFX96);凝膠成像儀(Image Quant,型號(hào):LAS 4010);病理圖文分析系統(tǒng)(日本,型號(hào):DP72CCD)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法

100只SPF級(jí)雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,80只大鼠采用自體移植法結(jié)合冰浴復(fù)制腎陽(yáng)虛血瘀型EMs模型[8-9],設(shè)假手術(shù)組20只。造模前3 d所有實(shí)驗(yàn)大鼠以戊酸雌二醇片1 mg/kg灌胃,每日檢測(cè)其陰道細(xì)胞學(xué)涂片,人工造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于統(tǒng)一的動(dòng)情周期。造模時(shí)手術(shù)全過(guò)程在小動(dòng)物麻醉機(jī)下進(jìn)行,采用異氟烷持續(xù)吸入方式麻醉大鼠,將異氟烷倒入麻醉機(jī)中,取1只大鼠放入誘導(dǎo)盒內(nèi),1 min后大鼠麻醉成功,取出仰臥位固定,并為其戴上面罩,以維持麻醉效果。碘伏常規(guī)消毒腹部皮膚,鋪巾,選取尿道口上方約3 cm處正中開腹,切口約2 cm,找到左側(cè)子宮,剪下中間一段子宮(約2 cm),立即置于無(wú)菌生理鹽水中,分離附著于子宮漿膜面脂肪組織,縱形剖開子宮,將分離好的子宮組織內(nèi)膜面緊貼在右側(cè)腹壁,并用4-0可吸收線將子宮塊對(duì)角縫合固定于腹腔內(nèi)壁,硫酸慶大霉素0.1 mL留置腹腔,逐層常規(guī)關(guān)腹。假手術(shù)組麻醉、開腹同上,只需找到其左側(cè)子宮后縫合腹部切口即可。手術(shù)操作保持無(wú)菌,全程操作5 min內(nèi)完成,術(shù)后注意保暖,待其自然蘇醒,蘇醒后正常清潔飼養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射慶大霉素0.1 mL預(yù)防感染,術(shù)后第4天除假手術(shù)組外開始冰浴,大鼠5只一籠,籠中加入0~1℃冰水混合物,深度為150 mm,每天1次,每次30 min,連續(xù)3周復(fù)制腎陽(yáng)虛血瘀型EMs模型(見圖1)。

圖1 自體移植法造模+冰水浸泡Note.A.Part of endometrium was transplanted into abdominal wall during autotransplantation.B.After autotransplantation.C.Soaked in ice water mixture.Figure 1 Model was made by autotransplantation and soaked in ice water

建模成功標(biāo)準(zhǔn):在內(nèi)異癥造模成功的基礎(chǔ)上出現(xiàn)腎陽(yáng)虛寒證表現(xiàn)[10-11]即為建模成功:(1)移植物體積增大;(2)移植物表面有血管形成;(3)移植物呈小囊狀,內(nèi)含清亮液體;(4)病理檢查移植物中有子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞;(5)大鼠出現(xiàn)身臟毛污,反應(yīng)遲鈍,蜷縮懶動(dòng),后肢行動(dòng)遲緩、寒戰(zhàn),扎堆怕冷、爪尾部蒼白,尾部皮下瘀紫、耳色蒼白等表現(xiàn)。

1.2.2 藥物制備及用藥方法

考慮到細(xì)胞作用區(qū)域的變形梯度較大(局域變形)，采用二階形函數(shù)可以得到更為準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。公式(2)(下標(biāo)2表示形函數(shù)階數(shù))給出了二階形函數(shù)的表達(dá)形式，具有更多的自由度，其參數(shù)矢量由一階形函數(shù)的12行增加為30行，能夠描述的變形也從一階變形(伸縮、轉(zhuǎn)動(dòng)、剪切或其組合)擴(kuò)展到二階變形(如梁的純彎曲)。

將所購(gòu)得的中藥免煎顆粒劑溶于雙蒸水中,制成補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方高劑量藥液(含生藥量4.625 g/mL)、補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方低劑量藥液(含生藥量1.85 g/mL)。將一粒孕三烯酮膠囊內(nèi)藥物溶于100 mL雙蒸水中,制成濃度為0.025 mg/mL的藥液。

移植術(shù)后第4天各組開始冰浴,同時(shí)按以下方案灌胃給藥,灌胃容積按照1 mL/100 g體重計(jì)算:中藥高劑量組:中藥高劑量藥液(46.25 g/kg,臨床等效劑量2.5倍),每天1次灌胃;中藥低劑量組:中藥低劑量藥液(18.5 g/kg,臨床等效劑量),每日1次灌胃;西藥組:孕三烯酮(0.25 mg/kg,臨床等效劑量),每周2次灌胃給藥,其余時(shí)間灌胃等體積的純凈水;模型組及假手術(shù)組同時(shí)灌胃等體積純凈水,連續(xù)灌胃3周。

1.2.3 組織的收集與處理

采用2%戊巴比妥鈉溶液以45 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉,開腹后觀察異位病灶形態(tài),迅速取出異位灶組織和在位子宮組織,稱重后部分組織置入4%多聚甲醛溶液中固定,部分組織置于液氮,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

(1)一般狀況觀察:觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的外觀、體重、精神狀態(tài)、飲食、二便等變化情況。開腹后觀察異位病灶組織生長(zhǎng)情況,HE染色于鏡下觀察異位病灶組織的病理學(xué)改變。

(2)機(jī)械痛閾值(PWT):在保持安靜的環(huán)境下將大鼠放置于透明的觀察箱中,使大鼠適應(yīng)環(huán)境約30 min,待其安靜后進(jìn)行測(cè)定。采用機(jī)械性電子測(cè)痛儀進(jìn)行測(cè)量,探針沿鐵絲網(wǎng)邊緣逐漸刺向大鼠后爪正中,后勻速施加壓力,當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮腿或逃跑行為時(shí),記錄儀器屏幕上所顯示的壓力值(精確度0.1 g),此壓力值即為機(jī)械痛域值。

(3)臟器指數(shù):稱取實(shí)驗(yàn)大鼠體重,麻醉后迅速取出其胸腺、脾和在位子宮,剪除多余脂肪組織,以生理鹽水清洗后稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重(mg)/體重(g)×100%。

(4)免疫組化檢測(cè)FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子的蛋白定位表達(dá):采用SP法,實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行:石蠟切片、烤片,二甲苯脫蠟2次,不同濃度梯度乙醇溶液水化后于蒸餾水中洗滌3次,滴加3%H2O2室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,PBS洗滌3次后進(jìn)行抗原修復(fù)20 min,后加正常山羊血清室溫孵育10 min,滴加一抗4℃過(guò)夜,次日滴加二抗常溫孵育15 min,PBS洗滌3次,滴加辣根過(guò)氧化物酶后進(jìn)行DAB顯色,蘇木精復(fù)染后脫水封片,顯微鏡下觀察組織中FoxO1、NF-κB、LC3-I、LC3-II及Beclin-1的表達(dá)情況。

(5)Western Blot測(cè)定FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子蛋白的表達(dá):將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管中,100 mg組織加入400μL裂解液,置于冰上用勻漿機(jī)充分研磨勻漿30 min,離心,提取上清液后,加入四分之一體積的5×上樣Buffer,震蕩混勻后變性,冷卻離心,放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑张浞脚渲?0%分離膠和5%濃縮膠,放入加滿電泳液的電泳槽中上樣,上樣結(jié)束后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%牛奶室溫封閉1 h、一抗4℃孵育過(guò)夜,次日用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5000)孵育1 h,顯色液A、B按1∶1配制發(fā)光液,用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白結(jié)果,采集圖片。實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,用Quantity One分析軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

(6)RT-PCR檢測(cè)FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的表達(dá):取組織經(jīng)液氮研磨,加入RNA裂解液,按照試劑盒方法提取組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度,然后配制20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體積進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得的cDNA于PCR儀應(yīng)用兩步法反應(yīng)程序上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),95℃10 min進(jìn)行預(yù)變性,然后進(jìn)行44個(gè)循環(huán)反應(yīng):95℃15 s,60℃60 s。引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成,GAPDH上游引物序列:5’-AGGAAATGATGAC CTCCTGAACT-3’,下游引物序列:5’-TGTTTTTGT AAGTATCTTGGTGCCT-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度79 bp;NF-κB上游引物序列:5’-TGTATTTCACGGGACCTGGC-3’,下游引物序列:5’-CAGGCTAGGGTCAGCGTATG-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度110 bp;FoxO1上游引物序列:5’-CAGCCAGGCACCTCATAACA-3’,下游引物序列:5’-TCAAGCGGTTCATGGCAGAT-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度143 bp;LC3-I上游引物序列:5’-TTGGTCAAGATCAT CCGGCG-3’,下 游 引 物 序 列:5’-CGAAGGTTT CTTGGGAGGCA-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度172 bp;LC3-II上游引物序列:5’-TGTTAAGCCCCTACCAAGGC-3’,下游引物序列:5’-ATGGCACTCAGTTTCTGGCT-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度129 bp;Beclin-1上游引物序列:5’-AACTCTGGAGGTCTCGCTCT-3’,下游引物序列:5’-CGCCTTAGACCCCTCCATTC-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度131 bp。擴(kuò)增完畢后,進(jìn)入結(jié)果分析界面,以GAPDH為內(nèi)參照基因,得到各樣本各目的基因及內(nèi)參基因的Cq值,按照公式Q=2-ΔCq,得到每個(gè)目的基因的Q值及Q均值,再以每個(gè)目的基因的Q值/Q均值,即各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值),將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)者,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較用SNK法,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況及異位灶觀察

移植術(shù)后21 d,與假手術(shù)組大鼠相比,其余4組大鼠均陸續(xù)出現(xiàn)體溫下降、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、蜷縮拱背、抱團(tuán)少動(dòng)、畏寒肢冷、行動(dòng)遲緩、便溏、體毛稀疏、雜亂無(wú)光澤、采食量與飲水量減少等癥狀,初步判斷腎陽(yáng)虛血瘀型證候模型成功。EMs主要病理性增殖的外在表現(xiàn)為異位病灶的生長(zhǎng)及體積的變化,開腹探查,除假手術(shù)組外,其余各組均見移植物生長(zhǎng),造模成功率為100%。大體觀察可見模型組的異位病灶體積明顯增大,重量增加,腹壁上可形成單個(gè)或多個(gè)小囊泡,呈半透明狀,內(nèi)含大量透明或淡黃色清亮液體,質(zhì)地柔軟,囊泡表面覆蓋著豐富的血管網(wǎng),與周圍組織粘連明顯。與模型組相比,各治療組異位病灶的體積明顯減小、重量減少、內(nèi)含液體減少、血管形成不明顯、粘連情況也較少(見圖2)。

圖2 各組EMs大鼠異位病灶的生長(zhǎng)情況比較Note.A.Model group.B.High dose group.C.Low dose group.D.Western medicine group.Figure 2 Comparison of the growth of ectopic lesions in EMSrats of each group

2.2 各組異位病灶的組織病理學(xué)觀察

異位病灶HE染色后于鏡下觀察,假手術(shù)組的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整、上皮細(xì)胞呈長(zhǎng)柱狀排列、整齊連續(xù),多數(shù)為間質(zhì)細(xì)胞,腺體和血管豐富;模型組可見異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞以低柱狀細(xì)胞或立方狀細(xì)胞為主,呈環(huán)形或鋸齒狀生長(zhǎng),部分區(qū)域內(nèi)膜也可呈乳頭狀生長(zhǎng),且有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),其間質(zhì)層可見血管豐富,腺體數(shù)量減少,甚至消失,肌層結(jié)構(gòu)不清晰。中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組的異位內(nèi)膜均可見不同程度的上皮細(xì)胞變薄,多為扁平狀或低立方狀,呈現(xiàn)出萎縮性改變,部分異位內(nèi)膜腺上皮明顯被破壞甚至消失(見圖3)。

圖3 補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)大鼠子宮及異位灶組織病理的影響Figure 3 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on the pathology of uterus and ectopic focus in rats

2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠之間機(jī)械痛域值的變化

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠所測(cè)得的機(jī)械痛閾值顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組大鼠所測(cè)得的機(jī)械痛閾值顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠之間機(jī)械痛閾值的比較(±S,n=20)Table 1 Comparison of mechanical pain threshold among groups(±S,n=20)

表1 各組大鼠之間機(jī)械痛閾值的比較(±S,n=20)Table 1 Comparison of mechanical pain threshold among groups(±S,n=20)

注:與假手術(shù)組相比,*P<0.05;與模型組相比,▲P<0.05。Note.Compared with sham operation group,*P<0.05.Compared with model group,▲P<0.05.

組別Groups機(jī)械痛域值Mechanical pain threshold假手術(shù)組Sham operation group 72.32±10.58模型組Model group 55.92±11.22*中藥高劑量組High dose group 72.07±20.78▲中藥低劑量組Low dose group 71.73±22.20▲西藥組Western medicine group 67.37±22.61▲

2.4 對(duì)臟器指數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠的胸腺、脾及子宮指數(shù)均顯著降低(P<0.05,P<0.01);與模型組相比較,中藥高劑量組的胸腺及子宮指數(shù)顯著上升(P<0.05,P<0.01),脾指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中藥低劑量組和西藥組的胸腺、脾及子宮有上升趨勢(shì),但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀型EMs大鼠胸腺、脾及子宮指數(shù)的影響(±S,n=20)Table 2 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on thymus,spleen and uterus index of EMSrats with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome(±S,n=20)

表2 補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方對(duì)腎陽(yáng)虛血瘀型EMs大鼠胸腺、脾及子宮指數(shù)的影響(±S,n=20)Table 2 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on thymus,spleen and uterus index of EMSrats with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome(±S,n=20)

注:與假手術(shù)組相比,*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。(下圖/表同)Note.Compared with sham operation group,*P<0.05,**P<0.01.Compared with model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.(The same in the following figures and tables)

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2.5 各組大鼠在位內(nèi)膜和異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子蛋白的定位表達(dá)比較

免疫組織化學(xué)染色顯示,FoxO1、Beclin-1、LC3和NF-κB免疫陽(yáng)性顯色均呈現(xiàn)棕黃色,FoxO1主要定位于子宮腺體腺上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi);Beclin-1在腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),主要定位于腺上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi);LC3主要定位于腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi);NF-κB免疫陽(yáng)性顯色呈現(xiàn)棕黃色,腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),主要定位于腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),胞核中偶見少量表達(dá)(見圖4,5)。

圖4 各組大鼠在位內(nèi)膜中FoxO1、Beclin-1、LC3及NF-κB的定位表達(dá)情況Figure 4 Localization and expression of FoxO1、Beclin-1、LC3 and NF-κB in eutopic endometrium of rats in each group

圖5 各組大鼠異位灶中FoxO1、Beclin-1、LC3及NF-κB的定位表達(dá)情況Figure 5 Localization and expression of FoxO1、Beclin-1、LC3 and NF-κB in ectopic foci of rats in each group

2.6 各組大鼠在位內(nèi)膜和異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子蛋白水平的比較

與假手術(shù)組的在位內(nèi)膜相比,模型組在位內(nèi)膜的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的蛋白含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組的在位內(nèi)膜FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II蛋白含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見圖6)。與模型組相比,中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組異位灶FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II蛋白含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見圖7)。

圖6 各組大鼠在位內(nèi)膜中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子蛋白含量Figure 6 Protein contents of FoxO1,NF-κBand autophagy related factors in eutopic endometrium of rats in each group

圖7 各組大鼠異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子蛋白含量Figure 7 Protein contents of FoxO1,NF-κB and autophagy related factors in ectopic lesions of rats in each group

2.7 各組大鼠在位內(nèi)膜和異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的比較

與假手術(shù)組的在位內(nèi)膜相比,模型組在位內(nèi)膜的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-IImRNA表達(dá)均增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,中藥高劑量組、中藥低劑量組和西藥組的在位內(nèi)膜FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表達(dá)均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見表3)。

表3 各組EMs大鼠在位內(nèi)膜中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的比較(±S)Table 3 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in eutopic endometrium of EMs rats in each group(±S)

表3 各組EMs大鼠在位內(nèi)膜中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的比較(±S)Table 3 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in eutopic endometrium of EMs rats in each group(±S)

組別Groups FoxO1 Beclin-1 LC3-I LC3-II NF-κB假手術(shù)組Sham operation group 0.74±0.25 1.27±0.71 1.31±0.78 1.03±0.61 1.22±0.64模型組Model group 1.14±0.48* 2.21±0.96* 2.96±0.83** 1.74±0.54* 2.24±0.72*中藥高劑量組High dose group 0.86±0.29▲ 1.21±0.45▲ 1.20±0.42▲ 0.81±0.42▲ 0.90±0.37▲中藥低劑量組Low dose group 0.91±0.37▲ 1.96±0.89▲ 1.56±0.87▲ 1.56±0.73▲ 1.76±0.89▲西藥組Western medicine group 0.60±0.21▲▲ 0.87±0.47▲ 0.81±0.31▲▲ 0.57±0.23▲ 0.69±0.34▲

與模型組相比,中藥高劑量組和西藥組異位病灶中FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表達(dá)均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);中藥低劑量組異位病灶的Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表達(dá)均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);FoxO1、NF-κB mRNA的表達(dá)也呈現(xiàn)降低趨勢(shì),但與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組EMs大鼠異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的比較(±S)Table 4 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in ectopic foci of EMs rats in each group(±S)

表4 各組EMs大鼠異位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相關(guān)因子mRNA的比較(±S)Table 4 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in ectopic foci of EMs rats in each group(±S)

組別Groups FoxO1 Beclin-1 LC3-I LC3-II NF-κB模型組Model group 1.38±0.17 1.07±0.34 1.15±0.14 1.58±0.20 1.44±0.19中藥高劑量組High dose group 0.68±0.12* 0.54±0.21* 0.43±0.16** 0.71±0.23* 0.69±0.29*中藥低劑量組Low dose group 1.00±0.34 0.61±0.24* 0.63±0.25* 1.17±0.39* 0.81±0.25西藥組Western medicine group 0.22±0.03** 0.14±0.05** 0.11±0.03** 0.49±0.19** 0.29±0.09**

2.8 NF-κB與FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的相關(guān)性分析

用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn),將NF-κB分別與FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II進(jìn)行相關(guān)性分析后表明,FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II與NF-κB均呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)依次為0.905,0.914,0.918,0.931(P<0.01)(見圖8)。

圖8 NF-κB與FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的相關(guān)線性表達(dá)Note.A.Correlation analysis of NF-κB and FoxO1.B.Correlation analysis of NF-κB and Beclin-1.C.Correlation analysis of NF-κB and LC3-I.D.Correlation analysis of NF-κB and LC3-II.Figure 8 Linear expression of NF-κB was correlated with FoxO1,Beclin-1,LC3-I and LC3-II

3 討論

EMs屬于中醫(yī)“癥瘕”“痛經(jīng)”“月經(jīng)不調(diào)”“不孕”等范疇,基本病機(jī)為“瘀血內(nèi)阻沖任、胞宮”,腎虛為本,血瘀為標(biāo),屬本虛標(biāo)實(shí)之證[12]。依據(jù)中醫(yī)“審因論治、治病求本”的治則,多在活血化瘀的基礎(chǔ)之上,以臟腑氣血為綱,辨證施治,補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方具有補(bǔ)腎溫陽(yáng),化瘀行滯之功。方中元胡除風(fēng)邪,調(diào)節(jié)氣血;肉桂、吳茱萸補(bǔ)腎溫陽(yáng),散寒止痛,可破血通行,祛除腹中之寒氣;小茴香、制附子溫機(jī)體之陽(yáng)氣,暢通經(jīng)脈,祛寒止痛;川芎行氣活血,桑寄生補(bǔ)益肝腎等,全方標(biāo)本兼治,能夠改善患者疼痛癥狀,提高生活質(zhì)量,并能夠調(diào)節(jié)患者紊亂的生殖激素水平、抑制血管的生成,改善乏氧狀態(tài),從而抑制EMs的發(fā)展[13-15]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),EMs細(xì)胞自噬功能的異常是機(jī)體陰陽(yáng)失衡的微觀表現(xiàn)[16],是探討中醫(yī)藥微觀機(jī)制的新思路,這為從細(xì)胞自噬角度探索補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療EMs的作用機(jī)制提供了理論上的支持,也是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的有效途徑。

細(xì)胞自噬即“自我吞噬”,是真核生物進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)高度保守的過(guò)程,主要發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中,利用溶酶體進(jìn)行自我清除和降解自身受損的細(xì)胞器,以維持細(xì)胞生命活動(dòng)及機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[17]。自噬以其特異的清除和代謝功能與中醫(yī)理論的對(duì)立制約、互根互用、追求陰陽(yáng)平衡的內(nèi)涵不謀而合[18]。自噬就是在陰陽(yáng)消長(zhǎng)過(guò)程中維持著機(jī)體微觀的平和,其太過(guò)或不及都可能引起機(jī)體的陰陽(yáng)失衡,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。有研究表明自噬與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但結(jié)論不一。有學(xué)者報(bào)道EMs患者的異位內(nèi)膜的自噬水平是下降的[19],也有學(xué)者認(rèn)為EMs的發(fā)展中其自噬水平是增高的[20]。由此可見,自噬在EMs進(jìn)展的過(guò)程中可能呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,

其發(fā)生受到多種相關(guān)信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)控。其中,FoxO1在細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)過(guò)程中起著不可或缺的重要作用,通過(guò)其乙?；?去乙?；⒘姿峄?去磷酸化過(guò)程的特異性調(diào)節(jié)[21]影響細(xì)胞自噬的水平[22]。NF-κB廣泛參與機(jī)體炎癥、細(xì)胞自噬等生理病理過(guò)程[5],活化的NF-κB誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生的同時(shí)也引起自噬調(diào)控關(guān)鍵因子微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的聚集和Beclin-1的泛素化,進(jìn)而激活細(xì)胞自噬[23],加速疾病的發(fā)展進(jìn)程。本研究通過(guò)比較模型組和假手術(shù)組大鼠大體一般狀態(tài)、機(jī)械痛閾值及臟器系數(shù)等變化,判定成功建立了腎陽(yáng)虛血瘀型EMs模型,補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療后能明顯改善以上指標(biāo)。通過(guò)免疫組化、PCR及Western Blot等多種實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),模型組在位內(nèi)膜及異位灶的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ的表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組,又通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)NF-κB與FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II在EMs在位內(nèi)膜中的表達(dá)呈正相關(guān),結(jié)果提示在EMs發(fā)展中異常表達(dá)的FoxO1可能通過(guò)刺激NF-κB的活化,促進(jìn)炎癥因子的增加,誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬水平的升高,為“異位”的內(nèi)膜細(xì)胞提供了物質(zhì)能量,使其容易在異位處存活,進(jìn)一步侵襲、發(fā)展、擴(kuò)散,細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)失衡無(wú)法維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,血脈運(yùn)行受阻,血不歸經(jīng),瘀積成癥,日久傷陽(yáng),使機(jī)體陰陽(yáng)失衡。經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方治療后在位內(nèi)膜及異位灶的FoxO1、NFκB、Beclin-1、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ水平明顯降低,表明補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方可能通過(guò)降低FoxO1的含量,減少NF-κB的活化,減輕局部炎癥反應(yīng),抑制了細(xì)胞自噬水平,改善細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境,溫陽(yáng)益腎以扶正,活血祛瘀以祛邪,共奏平衡陰陽(yáng)之效,從而發(fā)揮有效治療EMs的作用。

綜上所述,由于多種復(fù)雜因素的共同參與,使得EMs的子宮內(nèi)膜組織中FoxO1表達(dá)上調(diào),而FoxO1的活化引起NF-κB的過(guò)度表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞自噬的水平,使子宮內(nèi)膜的性狀發(fā)生了改變,加劇了EMs盆腹腔缺血缺氧的微環(huán)境,進(jìn)一步刺激FoxO1的表達(dá)增加,使FoxO1、NF-κB、自噬機(jī)制進(jìn)入正反饋循環(huán),“異位”內(nèi)膜不斷浸潤(rùn),久則瘀血無(wú)所出路,阻滯沖任、胞宮,陽(yáng)氣推動(dòng)無(wú)力,使得實(shí)邪持續(xù)存在并愈加嚴(yán)重,日久成癥,進(jìn)一步損傷人體之陽(yáng),加重機(jī)體陰陽(yáng)失衡,加速EMs的發(fā)展進(jìn)程。中醫(yī)藥在治療EMs過(guò)程中以調(diào)整陰陽(yáng)平衡,扶正祛邪為主,貫徹“謹(jǐn)察陰陽(yáng)所在而調(diào)之,以平為期”的論治思路。補(bǔ)腎溫陽(yáng)化瘀方能夠抑制在位、異位內(nèi)膜中FoxO1的表達(dá),減少NF-κB的激活,降低細(xì)胞自噬水平,一方面抑制能量供應(yīng)使得異位內(nèi)膜種植生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足而萎縮,另一方面自噬能力的不足可導(dǎo)致細(xì)胞耐受缺血缺氧的能力下降從而使細(xì)胞死亡。本方具有活血化瘀之功,使瘀血之邪得以消散,離經(jīng)之血得以歸經(jīng);同時(shí)溫陽(yáng)補(bǔ)腎,使“血得溫則行”,通過(guò)充盈自身正氣而祛邪,進(jìn)而調(diào)整機(jī)體的陰陽(yáng)相對(duì)平衡,恢復(fù)“陰平陽(yáng)秘”的狀態(tài),緩解癥狀,最終達(dá)到改善EMs的目的。