5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的毒力及其生理酶活性的影響

樊宗芳，宋潔蕾，桂富榮,2，和淑琪*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南省生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)又稱(chēng)苜蓿薊馬，屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬(張桂芬等,2011)，是一種全球性外來(lái)入侵物種，具有寄主范圍廣、生活場(chǎng)所隱秘、個(gè)體小、生殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)發(fā)育快、易對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，會(huì)對(duì)蔬菜、花卉等造成毀滅性危害(Reitzetal.，2020，2011)?；ㄋE馬F.intonsa(Trybom)是西花薊馬的本地近緣種，在云南廣泛分布，可危害花卉、蔬菜、水稻等作物(Qianetal.,2017)。除直接取食危害外，西花薊馬和花薊馬均是番茄斑萎病毒屬病毒的主要傳播媒介(Jones,2005; Ullmanetal.,2002; Whitfieldetal.,2005)，并且所致?lián)p失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)直接取食危害(Reitz,2009; Zhangetal.,2019)。

目前，薊馬類(lèi)害蟲(chóng)的防治仍以化學(xué)防治為主，混配殺蟲(chóng)劑的大量使用加速了薊馬類(lèi)害蟲(chóng)的抗藥性發(fā)展，致使常用藥劑效果顯著下降，防治困難加劇(付步禮等,2014)。研究表明，西花薊馬較花薊馬對(duì)高濃度CO2、藥劑脅迫適應(yīng)能力更強(qiáng)(胡昌雄等,2018; 劉建業(yè)等,2017；Heetal.,2017)。充分了解西花薊馬與本地近緣種花薊馬對(duì)常用殺蟲(chóng)劑的敏感性差異，有利于詮釋入侵薊馬種類(lèi)與本地薊馬種類(lèi)之間的種群動(dòng)態(tài)關(guān)系，因地制宜選擇合適的殺蟲(chóng)劑，延緩抗性發(fā)展速度。

外界環(huán)境變化時(shí)昆蟲(chóng)體內(nèi)酶系會(huì)被各種外源或內(nèi)源化合物誘導(dǎo)，使昆蟲(chóng)能夠迅速找到最適的生存對(duì)策(李燦等,2007)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)是昆蟲(chóng)體內(nèi)3種重要的保護(hù)酶，昆蟲(chóng)可通過(guò)改變體內(nèi)保護(hù)酶的活性增強(qiáng)其耐藥性和抗逆性(賈變桃等,2016)。此外，羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，AChE)是昆蟲(chóng)體內(nèi)3種重要的代謝酶系，能夠代謝大量的外源毒素，是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境脅迫及植物防御的重要方式(Tiwarietal.,2011)。

本研究測(cè)定了5種不同作用機(jī)理的殺蟲(chóng)劑對(duì)入侵物種西花薊馬及本地近緣種花薊馬的室內(nèi)毒力，比較了2種薊馬體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性差異，旨在為合理選擇高效殺蟲(chóng)劑，科學(xué)防治該類(lèi)害蟲(chóng)及進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

西花薊馬和花薊馬均采自云南省昆明市呈貢縣斗南鎮(zhèn)花卉苗圃培育基地(102°46′56.15″E，24°54′14.63″N)。四季豆PhaseolusvulgarisL.(種子購(gòu)于南京金盛達(dá)種子有限公司)置于室內(nèi)八角瓶中種植。飼養(yǎng)條件：人工氣候箱溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度65%±5%、光周期16 L∶8 D，連續(xù)飼養(yǎng)30代以上，期間未接觸任何殺蟲(chóng)劑。

1.2 供試藥劑及試劑盒

60 g·L-1乙基多殺菌素懸浮劑(美國(guó)陶氏益農(nóng)公司)、70%吡蟲(chóng)啉水分散粒劑(江蘇東寶農(nóng)化股份有限公司)、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(甲維鹽，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)、1.8%阿維菌素乳油(河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司)、25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑[先正達(dá)(中國(guó))投資有限公司]。

保護(hù)酶及解毒酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 5種藥劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的毒力測(cè)定 參照NY/T 1154.16-2013《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則》，將供試藥劑按等差或等比數(shù)列稀釋成5個(gè)濃度，每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)，以清水為對(duì)照。采用浸漬法進(jìn)行毒力測(cè)定：培養(yǎng)皿(d=9 cm)用不同濃度的藥液浸泡1 h，自然晾干；四季豆豆莢(長(zhǎng)度5 cm)用藥液浸泡30 s，自然晾干后放入對(duì)應(yīng)濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿1根，并分別接入羽化2 d的西花薊馬或花薊馬成蟲(chóng)各50頭，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，用昆蟲(chóng)針在保鮮膜上扎40～50個(gè)孔，以保證氣體流通，置于人工氣候箱中。48 h后記錄試蟲(chóng)死亡數(shù)(用毛筆輕觸蟲(chóng)體無(wú)反應(yīng)記為死亡)。

1.3.2 酶源制備 取羽化2 d的西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)，分別用5種殺蟲(chóng)劑的亞致死濃度(LC25)處理48 h，收集處理后存活的西花薊馬和花薊馬各0.2000 g(約12500頭)，加入9倍量生理鹽水，在冰浴條件下勻漿，將勻漿液于4 ℃、7500 r·min-1離心10 min，取上清液為SOD、POD、CAT、GST和AChE的測(cè)定酶源；收集處理后存活的西花薊馬和花薊馬各0.2000 g(約12500頭)，加入2 mL試劑盒中的試劑一，在冰浴條件下勻漿，將勻漿液置于4 ℃、12000 r·min-1離心30 min，取上清液為CarE測(cè)定酶源。

1.3.3 酶活性測(cè)定 SOD、POD、CAT、GST、AChE和CarE活性測(cè)定參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件Probit模塊擬合毒力回歸方程，并計(jì)算殺蟲(chóng)劑亞致死濃度(LC25)和致死中濃度(LC50)，同一藥劑對(duì)2種薊馬的毒力比值(西花薊馬LC50/花薊馬LC50)采用TDR(toxicity difference ratio)表示(Lu & Gao,2009)；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(t-test)分析同一藥劑處理不同物種以及處理和對(duì)照的差異顯著性；采用one-way ANOVA(Duncan′s)分析不同藥劑處理同一物種的差異顯著性，顯著水平設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種農(nóng)藥對(duì)西花薊馬及花薊馬的室內(nèi)毒力

由表1可知，乙基多殺菌素、甲維鹽、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)西花薊馬的毒力均低于花薊馬(乙基多殺菌素：t=5.712,P<0.05；甲維鹽：t=6.137,P<0.01；吡蟲(chóng)啉：t=3.874，P<0.05；噻蟲(chóng)嗪：t=12.866，P<0.001)，毒力差異比(TDR)均大于2.0，其中乙基多殺菌素對(duì)2種薊馬的TDR最高，達(dá)9.66。相反，阿維菌素對(duì)西花薊馬的毒力顯著高于花薊馬(t=-6.295，P<0.05)，TDR為0.03。此外，5種殺蟲(chóng)劑對(duì)同一種薊馬的毒力也存在一定差異，5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的毒力大小依次為：乙基多殺菌素>甲維鹽>阿維菌素>吡蟲(chóng)啉>噻蟲(chóng)嗪。

表1 5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的毒力

2.2 5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬與花薊馬保護(hù)酶活性的影響

清水對(duì)照的西花薊馬SOD活性顯著高于花薊馬SOD活性，且是花薊馬的1.32倍(圖1A)。5種殺蟲(chóng)劑的亞致死劑量(LC25)對(duì)西花薊馬SOD活性均呈顯著誘導(dǎo)作用。其中，阿維菌素對(duì)西花薊馬SOD活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，為326.40 U·mg-1，是對(duì)照的9.37倍；而對(duì)于花薊馬，乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素對(duì)其SOD活性有顯著誘導(dǎo)作用，吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)SOD活性影響不顯著，其中，乙基多殺菌素對(duì)花薊馬SOD活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，為245.35 U·mg-1，是對(duì)照的9.32倍。阿維菌素、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪處理后西花薊馬SOD活性高于花薊馬SOD活性(P<0.05)，分別是花薊馬的1.53、1.73和1.49倍；乙基多殺菌素和甲維鹽處理后，西花薊馬體內(nèi)SOD活性則顯著低于花薊馬SOD活性。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)POD活性略低于花薊馬POD活性(P>0.05)，是花薊馬的0.67倍(圖1B)。乙基多殺菌素、甲維鹽、阿維菌素和吡蟲(chóng)啉對(duì)西花薊馬和花薊馬POD活性呈顯著誘導(dǎo)作用，其中，吡蟲(chóng)啉對(duì)西花薊馬和花薊馬誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，分別為298.67和246.79 U·mg-1，是對(duì)照的37.10和20.57倍；噻蟲(chóng)嗪對(duì)西花薊馬POD活性呈誘導(dǎo)作用，而對(duì)花薊馬POD活性呈抑制作用(P>0.05)。而經(jīng)甲維鹽和阿維菌素處理后，2個(gè)物種之間POD活性差異不顯著；乙基多殺菌素、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪處理后西花薊馬體內(nèi)POD活性顯著高于花薊馬POD活性，分別為花薊馬POD活性的1.34、1.21和2.55倍。

清水對(duì)照的西花薊馬體內(nèi)CAT活性顯著低于花薊馬CAT活性，是花薊馬的0.70倍(圖1C)。阿維菌素和噻蟲(chóng)嗪對(duì)西花薊馬體內(nèi)CAT活性有顯著誘導(dǎo)作用，而甲維鹽對(duì)西花薊馬體內(nèi)CAT活性有顯著抑制作用，乙基多殺菌素和吡蟲(chóng)啉對(duì)其沒(méi)有顯著影響；對(duì)于花薊馬，阿維菌素對(duì)CAT活性有顯著的誘導(dǎo)作用，而吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪則顯著抑制CAT活性，乙基多殺菌素和甲維鹽對(duì)其沒(méi)有顯著影響；其中阿維菌素對(duì)西花薊馬和花薊馬CAT活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，分別為22.69和38.56 U·mg-1，是對(duì)照的1.42和1.69倍。甲維鹽和阿維菌素處理后，西花薊馬CAT活性顯著低于花薊馬CAT活性，僅為花薊馬CAT的0.58、0.34和0.59倍，吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪處理的西花薊馬CAT活性顯著高于花薊馬CAT活性，分別是花薊馬的5.20和2.57倍。

圖1 5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

2.3 5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬與花薊馬解毒酶活性的影響

清水處理的西花薊馬體內(nèi)CarE活性略低于花薊馬CarE活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.97倍(圖2A)。乙基多殺菌素、甲維鹽、阿維菌素和吡蟲(chóng)啉對(duì)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)CarE活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而噻蟲(chóng)嗪對(duì)2種薊馬的CarE活性沒(méi)有顯著影響，其中，阿維菌素對(duì)西花薊馬和花薊馬CarE活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，分別為12.53和11.99 U·mg-1，是對(duì)照的3.61和3.37倍。乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素處理后西花薊馬體內(nèi)CarE活性略高于花薊馬CarE活性，分別是花薊馬的1.05、1.10和1.05倍；而吡蟲(chóng)啉處理后西花薊馬CarE活性略低于花薊馬CarE活性(P>0.05)。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)GST活性略低于花薊馬GST活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.93倍(圖2B)。乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素對(duì)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)GST活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)2種GST活性沒(méi)有顯著影響，其中，乙基多殺菌素對(duì)西花薊馬和花薊馬薊馬的GST活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，分別為77527.59和66927.39 U·mg-1，是對(duì)照的1.56和1.26倍。5種殺蟲(chóng)劑處理后西花薊馬GST活性均高于花薊馬GST活性(P>0.05)。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)AChE活性略低于花薊馬AChE活性(P>0.05)，是花薊馬的0.88倍(圖2C)。乙基多殺菌素、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)2種薊馬AChE活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而甲維鹽和阿維菌素對(duì)兩種薊馬AChE活性沒(méi)有顯著影響，其中，乙基多殺菌素對(duì)西花薊馬和花薊馬AChE誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，分別為2.34和2.22 U·mg-1，是對(duì)照的3.44和2.88倍。乙基多殺菌素、阿維菌素和吡蟲(chóng)啉處理的西花薊馬AChE活性均高于花薊馬AChE活性，分別是花薊馬的1.05、1.49和1.54倍，而噻蟲(chóng)嗪處理的西花薊馬AChE活性略低于花薊馬AChE活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.90倍。

圖2 5種殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)CarE(A)、GST(B)、AChE(C)活性的影響

本研究結(jié)果表明，不同殺蟲(chóng)劑對(duì)不同薊馬體內(nèi)保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)和解毒酶(CarE、GST、AChE)活性的誘導(dǎo)或抑制作用不同。乙基多殺菌素僅抑制西花薊馬的CAT活性，對(duì)其他酶活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，但對(duì)花薊馬體內(nèi)的保護(hù)酶和解毒酶均呈誘導(dǎo)作用。甲維鹽抑制2種薊馬的CAT活性，但對(duì)其他酶活性均有誘導(dǎo)作用。阿維菌素、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)西花薊馬體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性均有誘導(dǎo)作用；而阿維菌素抑制花薊馬體內(nèi)AChE活性，吡蟲(chóng)啉抑制花薊馬體內(nèi)CAT活性，噻蟲(chóng)嗪對(duì)花薊馬體內(nèi)POD、CAT和GST活性具有抑制作用。

3 討論

外來(lái)物種成功入侵新的棲境后，往往較本地物種具有明顯的生理或生態(tài)優(yōu)勢(shì)(Qianetal.,2018)，能夠更快適應(yīng)不良的環(huán)境變化(如提高農(nóng)藥的耐受性等)，從而占據(jù)更多的可利用資源，并在與本地物種的競(jìng)爭(zhēng)中獲勝(Byers,2002; Petcheyetal.,1999)。本研究在室內(nèi)測(cè)定了不同藥劑對(duì)入侵種西花薊馬和本地近緣種花薊馬成蟲(chóng)的毒力，結(jié)果表明：乙基多殺菌素對(duì)西花薊馬的毒力最高(LC50=0.28 mg·L-1)，與張治科等(2019)所測(cè)結(jié)果類(lèi)似。乙基多殺菌素是微生物源殺蟲(chóng)劑，對(duì)環(huán)境友好，可將其作為防治薊馬的優(yōu)先選擇藥劑。西花薊馬對(duì)5種殺蟲(chóng)劑的敏感性普遍低于花薊馬，表明西花薊馬較花薊馬具有更強(qiáng)的耐藥性。Zhaoetal.(2017)和Reitzetal.(2020)研究表明，經(jīng)殺蟲(chóng)劑介導(dǎo)后，西花薊馬較本地薊馬表現(xiàn)出更強(qiáng)的種間競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

昆蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶(SOD、CAT和POD)相互協(xié)調(diào)，參與細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除，其中，SOD的功能是催化超氧陰離子自由基(O2-)歧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)，而CAT和POD具有分解H2O2的能力(Ahmad & Pardini，1990)，3種保護(hù)酶相互協(xié)調(diào)使自由基維持在一個(gè)較低的水平，從而避免自由基毒害(李周直等，1994)。在外界刺激物(如化學(xué)農(nóng)藥、不良環(huán)境因素等)的作用下，昆蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，從而維持正常的生理代謝(查黎春，2011)。本研究中，不同殺蟲(chóng)劑處理對(duì)2種薊馬體內(nèi)的保護(hù)酶活性的影響不盡相同。乙基多殺菌素和甲維鹽顯著誘導(dǎo)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)SOD和POD活性，但西花薊馬體內(nèi)SOD活性顯著低于花薊馬體內(nèi)SOD活性，說(shuō)明乙基多殺菌素和甲維鹽處理后西花薊馬相較于花薊馬產(chǎn)生更少的H2O2，從而避免了H2O2的毒害；乙基多殺菌素處理后，西花薊馬體內(nèi)POD活性顯著高于花薊馬，說(shuō)明西花薊馬通過(guò)誘導(dǎo)POD活性分解體內(nèi)的H2O2，從而降低其對(duì)機(jī)體的氧化損傷；而經(jīng)甲維鹽脅迫后，西花薊馬體內(nèi)POD活性略低于花薊馬，推測(cè)該差異是2種薊馬本身差異造成的；經(jīng)乙基多殺菌素和甲維鹽處理后，2種薊馬體內(nèi)CAT可能不參與對(duì)H2O2的分解。吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪對(duì)西花薊馬SOD活性呈顯著誘導(dǎo)作用，而對(duì)花薊馬SOD無(wú)顯著影響，同時(shí)吡蟲(chóng)啉顯著誘導(dǎo)2種薊馬POD活性，且西花薊馬POD活性顯著高于花薊馬POD活性，而噻蟲(chóng)嗪對(duì)2種薊馬POD活性無(wú)顯著影響；吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)嗪均對(duì)西花薊馬CAT活性有誘導(dǎo)作用，但顯著抑制花薊馬的CAT活性，說(shuō)明西花薊馬通過(guò)升高體內(nèi)POD和CAT活性來(lái)分解體內(nèi)大量H2O2，從而減輕其毒害作用。阿維菌素對(duì)2種薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，且西花薊馬SOD活性顯著高于花薊馬SOD活性，但西花薊馬體內(nèi)POD和CAT活性低于花薊馬，說(shuō)明阿維菌素對(duì)西花薊馬的氧化損傷高于花薊馬，這可能是西花薊馬對(duì)阿維菌素的敏感性強(qiáng)于花薊馬的原因之一。

昆蟲(chóng)的解毒酶系(AChE、CarE和GST)在對(duì)農(nóng)藥的代謝中起重要作用，解毒能力增強(qiáng)是昆蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因之一(楊慧等，2020)；昆蟲(chóng)解毒酶系的活性可以被各種外源、內(nèi)源化合物誘導(dǎo)，這使得昆蟲(chóng)在受到環(huán)境脅迫時(shí)體內(nèi)酶能迅速作出反應(yīng)，從而存活下來(lái)(王智卿和劉長(zhǎng)明，2010)。本研究中，對(duì)照西花薊馬解毒酶(CarE、AChE、GST)活性略低于花薊馬解毒酶活性，而經(jīng)乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素處理后，西花薊馬CarE活性則略高于花薊馬CarE活性；經(jīng)5種殺蟲(chóng)劑脅迫后，西花薊馬GST活性均高于花薊馬；乙基多殺菌素、阿維菌素和吡蟲(chóng)啉處理后，西花薊馬AChE活性高于花薊馬AChE活性，說(shuō)明西花薊馬可通過(guò)升高體內(nèi)解毒酶活性來(lái)應(yīng)對(duì)殺蟲(chóng)劑脅迫，也說(shuō)明入侵種西花薊馬較本地種花薊馬具有更強(qiáng)的解毒代謝能力。

昆蟲(chóng)受到化學(xué)藥劑脅迫后，體內(nèi)酶活性的變化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受不同藥劑類(lèi)型、藥劑處理濃度和時(shí)間、昆蟲(chóng)齡期等因素的影響(何發(fā)林等，2019; 張玨鋒等，2018)。本研究?jī)H比較了2種薊馬在不同殺蟲(chóng)劑LC25劑量下處理48 h后保護(hù)酶、解毒酶活性的變化，不同處理時(shí)間及不同處理濃度對(duì)其影響尚需進(jìn)一步研究。