南越國(guó)宮署遺址出土木質(zhì)水槽原位保存環(huán)境下的真菌多樣性*

方 旋 溫敬偉 陳 粵 范 敏 馬星霞

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091；2.南越王宮博物館 廣州 510030；3.廣州市翰瑞文物保護(hù)設(shè)計(jì)研究中心 廣州 510500)

近年來(lái)，隨著文物保護(hù)事業(yè)的發(fā)展和文物保護(hù)需求的增加，微生物技術(shù)在文物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多，發(fā)揮的作用越來(lái)越大，至2010年，文化遺產(chǎn)微生物學(xué)甚至已發(fā)展成為一門(mén)獨(dú)立的交叉學(xué)科而正式出現(xiàn)(Mitchelletal.，2010；徐潤(rùn)林，2013)。我國(guó)對(duì)文化遺產(chǎn)微生物學(xué)的研究實(shí)際早已開(kāi)始，特別是在古代壁畫(huà)和木質(zhì)棺槨的微生物病害方面有過(guò)很多報(bào)道(馮清平等，1998；湯顯春等，2003；葛琴雅等，2012)。

對(duì)于木質(zhì)文物，因木材為生物質(zhì)材料，故其最嚴(yán)重的生物敗壞是由真菌引起的(Zabeletal.，1992)。木材敗壞真菌按其對(duì)木材的敗壞特點(diǎn)不同可分為腐朽菌、變色菌和霉菌(馬星霞等，2011)，腐朽菌分泌降解酶，降解木質(zhì)素、纖維素或其他木材成分，導(dǎo)致木材腐朽、強(qiáng)度下降；霉菌和變色菌侵染木材表面，引起木材發(fā)霉和變色，產(chǎn)生真菌毒素，是致病性因子和過(guò)敏原，并可通過(guò)建筑從木質(zhì)構(gòu)件傳播到非木質(zhì)構(gòu)件，對(duì)建筑材料、構(gòu)筑物和居住者的健康產(chǎn)生直接或間接影響(馬星霞等，2011；Singh，1991；1996)。對(duì)于出土的飽水木質(zhì)文物，由于需要保濕保存，特別容易滋生霉菌，引起敗壞。在館藏環(huán)境中，霉菌會(huì)對(duì)博物館環(huán)境以及置身于其中的人員造成健康風(fēng)險(xiǎn)，因此，文物保護(hù)者對(duì)防霉殺菌的研究從未中斷(Singh，2000；胡東波等，2003；李東風(fēng)等，2013；陳家昌等，2015；丁佳榮等，2018)。

廣州南越國(guó)宮署遺址是2 000多年前西漢南越國(guó)的王宮所在地，也是1 000多年前五代十國(guó)南漢國(guó)都城興王府的宮殿區(qū)和宮苑所在，遺址中的木暗渠、木質(zhì)水槽等木質(zhì)文物(圖1)是研究秦漢時(shí)期歷史、科技、經(jīng)濟(jì)以及諸侯王宮城市排水系統(tǒng)的寶貴實(shí)物資料。其中的水井展示區(qū)遺址于2006年通過(guò)考古發(fā)掘揭露出來(lái)，2009年為配合遺址博物館建館需要，采取了臨時(shí)回填保護(hù)措施，至2011年底博物館館舍建筑完成后重新清理開(kāi)挖，并于2012年1月開(kāi)始對(duì)外開(kāi)放(溫敬偉，2019)。木質(zhì)水槽、木暗渠等木質(zhì)文物采取原位保存方式，渠體一半埋藏于地下，一半裸露展示供游客參觀，游客參觀棧道離地面約2 m。

圖1 南越國(guó)宮署遺址中的木質(zhì)水槽和木暗渠Fig.1 Wooden flume and underdrain in the Nanyue National Palace site

這些出土的飽水古木材，雖然長(zhǎng)期埋藏于地下環(huán)境中導(dǎo)致本身的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生一些變化，但是還保持著木材的主要成分，微生物侵蝕仍是其敗壞劣化的主要因素之一(馬菁毓，2004；王亞麗，2013)。出土前，木質(zhì)文物微生物降解主要來(lái)自侵蝕細(xì)菌和軟腐真菌(Blanchetteetal.,1991；Kimetal.,1996；Bj?rdaletal.，1999)；但當(dāng)被發(fā)掘出來(lái)暴露于空氣中后，環(huán)境因素發(fā)生劇烈變化，木質(zhì)文物更易遭受一些腐生真菌侵蝕(陳家昌等，2015；陳庚齡等，2009)。據(jù)南越王宮博物館文保工作人員介紹，對(duì)南越國(guó)宮署遺址發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)的木暗渠本體木材和附近土壤分別取樣進(jìn)行微生物分離鑒定，木材樣本分離鑒定出5種菌株，土壤樣本分離鑒定出3種菌株，木質(zhì)文物存在霉變和腐朽風(fēng)險(xiǎn)，因此博物館在對(duì)這些木質(zhì)文物進(jìn)行脫水處理后，2015年選取其中分布在遺址北部水井展示區(qū)的2段南越國(guó)木暗渠實(shí)施整體套取搬進(jìn)文物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行脫鹽脫水加固保護(hù)。在脫水加固保護(hù)過(guò)程中，借鑒以往木質(zhì)文物防腐經(jīng)驗(yàn)，首先在木暗渠構(gòu)件本體表面噴灑可降解防霉劑進(jìn)行消毒，然后用福爾馬林溶液處理木構(gòu)件以避免霉菌生長(zhǎng)。2017年完成脫水保護(hù)后至今，在日常保濕維護(hù)中，每周至少進(jìn)行1次防霉處理，采取了比較精細(xì)的保護(hù)管理辦法(溫敬偉，2019)。

由于南越國(guó)宮署遺址出土的木質(zhì)文物原位保存，與地面是接觸狀態(tài)，為弄清楚是否存在木材腐朽菌和其他敗壞微生物生長(zhǎng)，以及如何更好對(duì)遺址展示的木質(zhì)文物進(jìn)行本體保護(hù)，本研究對(duì)疑似真菌生長(zhǎng)的木質(zhì)水槽和真菌子實(shí)體樣本取樣，采用傳統(tǒng)組織分離技術(shù)分離純化真菌，并采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本真菌組成和豐度進(jìn)行測(cè)試，以期為評(píng)估木質(zhì)水槽微生物病害以及進(jìn)一步研發(fā)本體保護(hù)方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 木質(zhì)水槽病害勘察與標(biāo)本采集

現(xiàn)場(chǎng)勘察南越國(guó)宮署遺址出土的木質(zhì)水槽，對(duì)其疑似真菌生長(zhǎng)癥狀一一記錄拍攝，并用鑷子夾取帶有疑似組織的少量木材組織和子實(shí)體。為防止非靶標(biāo)菌污染，標(biāo)本采集后立即密封于牛皮紙袋中，迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離或冷藏在冰箱內(nèi)以逐步分離。

1.2 真菌分離純化

在無(wú)菌操作臺(tái)上挑取少量木材組織浸于濃度0.1%的升汞中表面消毒3～5 min，再用無(wú)菌水漂洗3遍，然后轉(zhuǎn)移到含50 μg·mL-1氨芐青霉素的2%瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待瓊脂培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落，沿菌落邊緣挑取單根菌絲在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)以獲得純化菌株；如果發(fā)現(xiàn)菌株性狀不純，則重復(fù)挑取單根菌絲培養(yǎng)直至獲得純化菌株(方中達(dá)，1998)。從土壤中采集的子實(shí)體樣本同樣進(jìn)行上述分離純化。

1.3 真菌生長(zhǎng)特性與生長(zhǎng)速度觀察

參照馬星霞等(2009)方法，將純化菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10天，用內(nèi)徑5 mm的打孔器打出菌餅，接種在倒有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于溫度28 ℃、相對(duì)濕度80%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察各真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)特性，測(cè)量每天生長(zhǎng)量，并在顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)特征，初步分辨真菌種類(lèi)。

1.4 真菌分子鑒定

1.4.1 基因組DNA抽提與PCR擴(kuò)增 收集純化菌株足夠量菌絲或孢子聚集體，外加子實(shí)體材料，參照Kirker等(2012)采用SDS-CTAB法提取各菌株基因組DNA，利用rDNA-ITS序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

DNA提取流程：取樣約0.1 g至1 mL移液管內(nèi)，向每份樣品中添加800 μL CTAB(含β-巰基乙醇)，用鉆/塑料杵研磨30 s，并在65 ℃下溫浴30 min～1 h。15 000g離心3 min后，上清液轉(zhuǎn)移到Promega Wizard SV基因組試劑盒(美國(guó)Promega)的離心柱中，按照操作流程進(jìn)行基因組DNA提取，提取的總DNA采用分光光度計(jì)(Thermo Scientific,美國(guó))進(jìn)行定量分析。

PCR引物序列(Whiteetal.，1990；Gardesetal.，1993)分別為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min后，隨即進(jìn)入92 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s的循環(huán),共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后于72 ℃延伸10 min,終止溫度4 ℃。

1.4.2 序列分析與分子鑒定 將PCR產(chǎn)物送樣至北京新時(shí)代眾合科技有限公司測(cè)序，序列在www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索和進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)合培養(yǎng)性狀進(jìn)行真菌分子鑒定。

1.5 真菌高通量測(cè)序分析

參照木材和木質(zhì)文物微生物群落研究方法(李東風(fēng)等，2013；丁佳榮等，2018)，提取樣本中所有微生物DNA，并利用PCR擴(kuò)增對(duì)DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增引物為真菌通用引物ITS1和ITS2：5′-GCGTTCTTCATCGATGC-3′。產(chǎn)物目的條帶大小正確且總量滿足建庫(kù)需要的送至北京奧維森科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq 2500高通量測(cè)序，得到真菌序列操作分類(lèi)單元OTUs(operational taxonomic units)，通過(guò)對(duì)相似水平97%以上的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析歸類(lèi)操作，了解樣本菌種、菌屬等數(shù)目信息。利用平臺(tái)及Qiime(Version 1.8.0，http:∥qiime.org/)和 Vsearch(2.7.1，https:∥github.com/torognes/vsearch)軟件對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行α多樣性分析。采用BLAST等方法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)，并在各分類(lèi)水平(門(mén)、綱、目、科、屬、種)注釋其群落的物種信息，分析物種組成和共有核心物種，進(jìn)行樣本聚類(lèi)分析和聚類(lèi)heatmap圖示，通過(guò)顏色梯度和相似程度反映多份樣本在各分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)水槽病害勘察與標(biāo)本采集

現(xiàn)場(chǎng)詳細(xì)觀察木質(zhì)水槽表面狀況，對(duì)白斑、疑似微生物子實(shí)體的革質(zhì)物質(zhì)以及菌絲樣絲狀物等一一記錄拍攝，采集疑似真菌侵染的木質(zhì)樣本4份，分別標(biāo)記為YN1、YN2、YN3和YN4，在水槽附近土壤中采集擔(dān)子菌傘狀子實(shí)體1份，標(biāo)記為YN5(圖2)。

圖2 木質(zhì)水槽和木暗渠病害Fig.2 Diseases of wooden flume and underdrain

2.2 真菌分離結(jié)果與培養(yǎng)性狀觀察

4份木質(zhì)樣本經(jīng)組織分離、純化共獲得21株純化菌株，通過(guò)初步培養(yǎng)性狀觀察結(jié)合分子鑒定得到11種真菌(表1)。

表1 各樣本分離到的真菌Tab.1 Fungi species isolated from each specimen

YN1分離到3株真菌，其中2株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)性狀類(lèi)似，菌落黃綠色，氣生菌絲在菌落中間厚重且突起，邊緣較薄且具輪紋；培養(yǎng)皿內(nèi)有多個(gè)小菌落，說(shuō)明孢子在培養(yǎng)過(guò)程中易彈射形成了新的生長(zhǎng)中心；顯微觀察其孢子囊無(wú)囊狀膨大，帚狀枝、輪生，瓶梗瓶狀，分生孢子小、球形，結(jié)合真菌PCR擴(kuò)增序列BLAST分析，鑒定其為子囊菌門(mén)(Ascomycota)散囊菌綱(Eurotiomycetes)散囊菌目(Eurotiales)曲霉科(Aspergillaceae)青霉屬(Penicillium)真菌(圖3中5號(hào)菌)；1株在PDA培養(yǎng)基上放射狀生長(zhǎng)，菌絲灰白，菌落土黃色，粉質(zhì)，從生長(zhǎng)性狀上難以鑒定，序列BLAST和進(jìn)化樹(shù)分析鑒定其為半知菌亞門(mén)(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)叢梗孢科(Moniliaceae)擬青霉屬(Paecilomyces)真菌(圖3中6號(hào)菌)。

YN2分離到4株真菌，其中2株在PDA培養(yǎng)基上與YN1分離到的青霉屬真菌生長(zhǎng)性狀類(lèi)似，分子鑒定為同一種菌；1株在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色綿狀，不產(chǎn)孢，從生長(zhǎng)性狀上難以鑒定，序列BLAST鑒定其為子囊菌綱(Ascomycetes)球殼目(Sphaeriales)蕉孢殼科(Diatrypaceae)毛狀彎孢聚殼座菌(Eutypella)(圖3中9號(hào)菌)；1株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌絲白色，不產(chǎn)孢，從生長(zhǎng)性狀上難以鑒定，序列BLAST鑒定其為枝頂孢霉菌(Acremonium)(圖3中4號(hào)菌)。

YN3分離到7株真菌，其中3株為木霉菌(Trichoderma)(圖3中12號(hào)菌)、2株為節(jié)菱孢霉菌(Arthrinium)(圖3中11號(hào)菌)、1株為鐮孢菌(Fusarium)(圖3中7號(hào)菌)、1株為枝孢瓶霉菌(Cladophialophora)(圖3中2號(hào)菌)。木霉菌在PDA培養(yǎng)開(kāi)始為綠色孢子團(tuán)鋪開(kāi)生長(zhǎng)，后菌絲生長(zhǎng)致密，孢子為淺綠色圓球狀，瓶梗短、小而多。節(jié)菱孢霉菌在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色絮狀，不產(chǎn)孢。鐮孢菌菌絲白色，放射狀生長(zhǎng)，孢子為鐮刀型典型孢子。枝孢瓶霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，有輪紋，菌絲黑灰色，致密，不產(chǎn)孢。

YN4分離到7株真菌，其中2株為曲霉菌(Aspergillus)(圖3中3號(hào)菌)、1株為籃狀菌(Talaromyces)(圖3中1號(hào)菌)、2株為木霉菌、1株為青霉菌、1株為鐮孢菌(圖3中10號(hào)菌)。曲霉菌菌絲短，邊緣暗藍(lán)色，中間灰色、皺縮，分生孢子多、球形或近球形?；@狀菌顏色鮮艷，生長(zhǎng)緩慢，邊緣菌絲白色，中部亮黃色突起，有小液滴滲出。鐮孢菌菌絲緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，鐮刀型孢子。

從土壤中采集的子實(shí)體樣本PDA培養(yǎng)純化菌株菌絲和子實(shí)體直接進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)合子實(shí)體性狀鑒定為純黃白鬼傘(Leucocoprinusbirnbaumii)(圖3中8號(hào)菌)，該菌在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲不發(fā)達(dá)，白色絮墊狀，有皺縮，生長(zhǎng)緩慢。

圖3 分離到的真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)性狀Fig.3 Growth characteristics of fungi isolated on PDA1.籃狀菌Talaromyces；2.枝孢瓶霉菌Cladophialophora；3.曲霉菌Aspergillus；4.枝頂孢霉菌Acremonium；5.青霉菌Penicillium；6.擬青霉菌Paecilomyces；7.鐮孢菌Fusarium；8.純黃白鬼傘Leucocoprinus birnbaumii；9.聚殼座菌Eutypella；10.鐮孢菌Fusarium；11.節(jié)菱孢霉菌Arthrinium；12.木霉菌Trichoderma.

包括子實(shí)體在培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株，所有樣本共分離到22株純化菌株，分屬于12種真菌，其中青霉菌和木霉菌分離比例較高，青霉菌在YN1、YN2和YN4樣本上共分離到5株，木霉菌在YN3和YN4樣本上共分離到4株。12種真菌生長(zhǎng)速度差別較大，木霉菌生長(zhǎng)最快，一般3天即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿；擬青霉菌、聚殼座菌、鐮孢菌、節(jié)菱孢霉菌生長(zhǎng)速度正常，每天生長(zhǎng)12～17 mm；其他菌生長(zhǎng)很慢，每天只生長(zhǎng)2～3 mm。

2.3 真菌多樣性分析

2.3.1 樣本真菌α多樣性 單樣本多樣性分析(α多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。表2中凈序列為去除嵌合體、短序列后的優(yōu)質(zhì)序列，Chao1值為菌種豐富度指數(shù)，用于估計(jì)群落中操作分類(lèi)單元(OTUs)數(shù)目，Chao1 值越大，微生物群落多樣性越大。凈序列采用聚類(lèi)(或降噪)方式生成OTUs，4份木質(zhì)樣本含有的OTUs分別為182、168、213和191，說(shuō)明每份樣本的群落多樣性均比較豐富。

表2 樣本α多樣性指數(shù)Tab.2 α diversity index of specimen

Shannon值用于估計(jì)樣本微生物群落多樣性，Shannon值越大，群落多樣性越高，4份木種樣本的Shannon值分別為4.58、2.77、2.58和3.23。Simpson 值兼顧群落豐富度和均勻度，與物種豐富度呈正相關(guān)。Good’s_coverage 是一個(gè)間接判斷測(cè)序數(shù)據(jù)是否足夠的指標(biāo)，其越接近1.0，樣本中序列被測(cè)出的概率越高，4份木質(zhì)樣本的Good’s_coverage皆為1.0，說(shuō)明測(cè)出的序列比較徹底，可代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

譜系多樣性指數(shù)兼顧物種豐度和進(jìn)化距離，基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)計(jì)算，用各樣本中OTUs的代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)距離，將某一樣本中所有代表序列的枝長(zhǎng)加和，數(shù)值越大，群落多樣性越高，4份木質(zhì)樣本的譜系多樣性指數(shù)最小為38.76，最大為47.01，YN2的群落多樣性較低，YN3的群落多樣性較高，與Chao1 值和OTUs反映的多樣性結(jié)果一致。

2.3.2 樣本在門(mén)、綱、目、科、屬上的物種組成 圖4顯示了相對(duì)豐度大于1%的樣本在門(mén)、屬分類(lèi)水平上的真菌種類(lèi)和相對(duì)豐度信息。在門(mén)水平上，4份木質(zhì)樣本均以子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)為主，且子囊菌門(mén)占比高于擔(dān)子菌門(mén)，子囊菌門(mén)占比分別為71%、78%、64%和92%，擔(dān)子菌門(mén)占比分別為18%、21%、35%和5%，YN4的子囊菌門(mén)占比最高，YN3的擔(dān)子菌門(mén)占比最高。在屬水平上，根據(jù)圖中顏色很容易看到各樣本菌落組成及大致占比和優(yōu)勢(shì)菌屬，結(jié)合圖5樣本物種組成可視化展示，能夠清楚看出各樣本在門(mén)、綱、目、科、屬、種上的真菌組成和比例以及種的分類(lèi)地位。YN1占比最高的是畸腔菌(Teratosphaeria)，比例為22%；YN2的優(yōu)勢(shì)菌屬為占比53%的外瓶霉菌(Exophiala)；YN3中有2種菌的占比較大且比例相當(dāng)，一是肉座菌目(Hypocreales)的一個(gè)菌種，占比44%，無(wú)法定義到具體種；二是擔(dān)子菌純黃白鬼傘，占比34%；YN4的優(yōu)勢(shì)菌屬為占比51%的曲霉菌。

圖4 樣本在門(mén)和屬上的物種組成Fig.4 Species composition of samples on phylum and genus

圖5 樣本物種組成可視化展示Fig.5 Visualization of sample species composition

2.3.3 核心OTUs分析 Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多份樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，直觀表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性和重疊情況。圖6顯示，4份木質(zhì)樣本均含有的OTUs數(shù)目33個(gè)，其中6個(gè)注釋不到具體屬種，剩余27個(gè)OTUs具體為22種真菌(表3)。

圖6 樣本VennFig.6 Venn of sample species

高山被孢霉菌和長(zhǎng)孢被孢霉菌屬于被孢菌門(mén)(Mortierellomycota)，帚狀費(fèi)爾氏酵母、費(fèi)爾氏酵母和純黃白鬼傘屬于擔(dān)子菌門(mén)，其他屬于子囊菌門(mén)。對(duì)照分離、純化的真菌種類(lèi)，土壤中的子實(shí)體培養(yǎng)物純黃白鬼傘在4份木質(zhì)樣本中均被檢測(cè)到，且在YN3中的占比較高；青霉菌以及分屬于鐮孢菌、曲霉菌、麥角菌、枝孢瓶霉菌和木霉菌的純化菌株均為4份木質(zhì)樣本中共有的真菌；枝頂孢霉菌屬于肉座菌目。4份木質(zhì)樣本在博物館不同位置和木質(zhì)水槽中采集，其共有的真菌應(yīng)屬于木質(zhì)水槽上廣泛存在的真菌，高通量測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)組織分離結(jié)果互相印證、互為補(bǔ)充。

2.3.4 樣本聚類(lèi)分析 圖7所示為4份木質(zhì)樣本中豐度較高的前20屬菌的聚類(lèi)分析?？梢钥闯觯S度較大的為外瓶霉菌、曲霉菌、畸腔菌、白鬼傘菌、費(fèi)爾氏酵母、木霉菌、枝孢瓶霉菌、鐮孢菌、紅酵母菌、Colacogloea、青霉菌、Papiliotrema、Acremoniopsis、Cyphellophora、Saitozyma、黑蔥花霉菌、Collarina、蠟孔菌和Uncispora，其中前11個(gè)屬于4份木質(zhì)樣本中共有的種類(lèi)。表4統(tǒng)計(jì)了4份木質(zhì)樣本優(yōu)勢(shì)菌分布及所占比例，可以看作整個(gè)博物館環(huán)境及木質(zhì)水槽和木暗渠中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)果，占比較大的分別為16.38%的外瓶霉菌、12.96%的曲霉菌、9.27%的畸腔菌和8.54%的純黃白鬼傘菌。

表4 樣本優(yōu)勢(shì)菌分布及所占比例Tab.4 The distribution of dominant fungi and their proportion

圖7 樣本豐度較高的前20屬菌的聚類(lèi)分析Fig.7 Cluster bar tree of the top 20 genus

3 討論

廣州地區(qū)空氣干濕變化大，對(duì)展廳內(nèi)的文物會(huì)造成一定影響，如果館內(nèi)使用空調(diào)，濕度減少會(huì)使文物龜裂，如果在室內(nèi)噴灑水霧，濕度增大則增加霉菌生長(zhǎng)機(jī)會(huì)(譚秋明等，2012)。南越王宮博物館在發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)曾對(duì)木暗渠本體木材和附近土壤分別取樣進(jìn)行微生物分離鑒定，木材樣本分離鑒定出5種菌株，分別為青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，土壤樣本分離鑒定出3種菌株，分別為鐮刀菌屬、青霉屬和葡萄球菌屬，在前期保護(hù)和日常維護(hù)中博物館采取了殺菌防霉措施(溫敬偉，2019)。本研究從采集到的病害標(biāo)本中仍分離到12種真菌，說(shuō)明目前的保護(hù)措施未能完全抑制木質(zhì)文物的敗壞微生物生長(zhǎng)，也說(shuō)明在原位展示和目前采取的防霉措施下，敗壞微生物也發(fā)生了變化。在分離到的真菌中，有一半種類(lèi)生長(zhǎng)非常緩慢，分析也許是對(duì)目前防霉劑的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

不同微生物對(duì)文物造成的病害不同，對(duì)文物的影響程度也不同，只有充分掌握病害微生物狀況，才能使保護(hù)措施達(dá)到預(yù)期效果(Bj?rdal，2012)。生物敗壞是群體作用而非單個(gè)微生物作用(R?llekeetal.，2000；范曉丹等，2015)，傳統(tǒng)組織分離方法不能獲取全部敗壞真菌，難于得到全面的真菌信息，而無(wú)需進(jìn)行真菌分離的基于DNA分析的擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)提供了很好地了解任何基質(zhì)上微生物群落多樣性的方法(Lindahletal.，2013；Maetal.，2017)。在文物上，這種方法常被用來(lái)分析彩塑、壁畫(huà)、墓室里以及遺址表面的微生物群落(武發(fā)思等，2012；2013；Duanetal.，2017；2018)。幸晶晶等(2018)采用該方法分析了飽水木漆器中的細(xì)菌病害信息，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了出土原址館藏環(huán)境下的木質(zhì)文物真菌病害多樣性。一般認(rèn)為，傳統(tǒng)組織分離技術(shù)對(duì)細(xì)菌的信息獲取率不足1%，而真菌可以達(dá)到很高的獲取率(Sterflinger,2010)。從本研究結(jié)果看，傳統(tǒng)組織分離技術(shù)的作用仍然有限，每份樣本據(jù)測(cè)序超過(guò)100個(gè)OTUs，但分離僅獲取12種菌株，而且測(cè)序顯示有些豐度很高的菌并沒(méi)有分離到。測(cè)序技術(shù)為全面了解木質(zhì)文物和館藏環(huán)境微生物病害信息提供了非常好的手段，不過(guò)，如果針對(duì)病害微生物篩選藥劑、實(shí)驗(yàn)室研究防治方法等仍需要分離出純菌，通過(guò)培養(yǎng)和保存，為后期針對(duì)特定菌群的防治措施提供基礎(chǔ)。

防止博物館霉菌生長(zhǎng)以及對(duì)污染物品制定適當(dāng)?shù)奶幚泶胧┦切迯?fù)者、博物館館長(zhǎng)和建筑師面臨的挑戰(zhàn)，因?yàn)槠洳粌H對(duì)物品的清潔和保存技術(shù)有影響，而且對(duì)修復(fù)者和其他博物館人員的職業(yè)安全和健康也有影響(Sterflinger，2010)。采集到子實(shí)體的擔(dān)子菌純黃白鬼傘是一種有毒真菌，在土壤中生存活力非常強(qiáng)，用常規(guī)辦法難以清除，多菌靈、百菌清、土霉素、農(nóng)用鏈霉素、甲基托布津等殺菌藥劑對(duì)其都不起作用，攝入后可引起嘔吐、惡心和腹瀉等癥狀(Duttaetal.，2011)。據(jù)本研究測(cè)序得知，4份木質(zhì)樣本中均或多或少含有此菌，雖然沒(méi)有在木質(zhì)文物上長(zhǎng)出子實(shí)體，但對(duì)木質(zhì)文物具有潛在的生物降解風(fēng)險(xiǎn)，具體是否會(huì)引起木材降解還需進(jìn)一步研究。

測(cè)序豐度最高的外瓶霉屬真菌在組織分離中并沒(méi)有得到，分析認(rèn)為：枝孢瓶霉屬和外瓶霉屬同屬于外瓶霉科，外瓶霉科在4份木質(zhì)樣本中所占比例分別為21%、55%、5%和0.7%，平均為20.4%，在博物館木質(zhì)水槽中占比優(yōu)勢(shì)明顯，由于序列BLAST庫(kù)的差異，與分離到的2號(hào)菌株枝孢瓶霉也許為同一種真菌。外瓶霉屬真菌對(duì)五氯酚和雜酚油都有很強(qiáng)的耐藥性(袁毅等，1996)，后續(xù)篩選合適的殺菌劑是個(gè)挑戰(zhàn)。

據(jù)報(bào)道，籃狀菌能合成降解木質(zhì)纖維素的酶(Simonaetal.，2018)，本研究得到的1株籃狀菌會(huì)不會(huì)對(duì)木材和木質(zhì)文物發(fā)生降解有待進(jìn)一步研究。

其他常見(jiàn)的容易產(chǎn)生分生孢子、在培養(yǎng)基上也具有明顯孢子團(tuán)聚生的曲霉菌、青霉菌、木霉菌和擬青霉菌等很容易使博物館中的微生物孢子量增加造成環(huán)境污染，建議建立微生物監(jiān)測(cè)制度，獲取微生物數(shù)量、種類(lèi)和多樣性變化信息，其定量和定性分析對(duì)文物本體表面和儲(chǔ)存環(huán)境保護(hù)均有重要意義(Lech，2015)。

4 結(jié)論

南越國(guó)宮署遺址出土的木暗渠和木質(zhì)水槽在原位保存和目前比較精細(xì)的保護(hù)措施下，依然有豐富的真菌生長(zhǎng)。經(jīng)傳統(tǒng)組織分離方法檢測(cè)到遺址木質(zhì)文物上有11種子囊菌，超過(guò)一半在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，土壤中采集到的子實(shí)體鑒定為有毒擔(dān)子菌純黃白鬼傘。高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到木質(zhì)文物中真菌群落組成以子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為主，其中子囊菌門(mén)占比高于擔(dān)子菌門(mén)。4份木質(zhì)樣本中普遍存在22種真菌，豐度較高的4種菌為外瓶霉菌(16.38%)、曲霉菌(12.96%)、畸腔菌(9.27%)和純黃白鬼傘(8.54%)。土壤中采集分離到的擔(dān)子菌純黃白鬼傘在木質(zhì)文物中也均被檢測(cè)到。這些真菌有些對(duì)環(huán)境和人群具有潛在的健康影響，有些造成木質(zhì)文物產(chǎn)生革質(zhì)、斑點(diǎn)等污漬，有些對(duì)木質(zhì)文物具有降解風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)真菌多樣性研究了解木質(zhì)文物原位保存與展示環(huán)境下微生物的種類(lèi)和豐度，其定量和定性分析對(duì)木質(zhì)文物本體和儲(chǔ)存、展示環(huán)境保護(hù)均有重要意義。傳統(tǒng)組織分離技術(shù)得到可實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)菌株不僅實(shí)際驗(yàn)證了真菌的存在，也為進(jìn)一步了解真菌對(duì)木質(zhì)文物的危害并有針對(duì)性地篩選合適的殺菌劑奠定基礎(chǔ)。