小菜蛾活化蛋白激酶C受體1基因PxyRACK1在變態(tài)發(fā)育調(diào)控中的作用

胡曉漢, 田素芬, 林 碩, 陳藝欣, 魏 輝, 顧曉軍,*, 黃勁飛,*

(1．福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350002; 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350013; 3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站, 福州 350013)

活化蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1, RACK1)是一種胞漿內(nèi)游離的WD-重復(fù)蛋白(WD-repeat protein)，廣泛存在于各類原核生物和真核生物中(段紅英等, 2007; Adamsetal., 2011)。WD-重復(fù)蛋白通常由4～10個(gè)重復(fù)的WD基元組成，WD基元得名于其C端含有色氨酸-天冬氨酸(WD)保守序列(Huetal., 2017)。在生物體內(nèi)，WD-重復(fù)蛋白具有組裝細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、運(yùn)輸囊泡、調(diào)控細(xì)胞周期等功能(Huetal., 2017)。

RACK1作為支架型蛋白，在生物體中參與了多種信號(hào)通路(代靜等, 2017)。在昆蟲(chóng)中也是如此，如在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中，RACK1作為折疊蛋白參與了自噬體的形成(érdietal., 2012)，并在p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)/RACK1通路中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)平衡從而影響細(xì)胞衰老和肌肉應(yīng)激反應(yīng)等(Belozerovetal., 2014)。近年來(lái)，RACK1在調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育方面的功能越來(lái)越受到關(guān)注。在果蠅(Kadrmasetal., 2007; Wangetal., 2012)、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(侯元春等, 2012)、云杉卷葉蛾Choristoneurafumiferana(Quanetal., 2006)中均發(fā)現(xiàn)RACK1能夠響應(yīng)蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)的誘導(dǎo)，參與蛋白磷酸化并激活下游轉(zhuǎn)錄因子。此外，RACK1還能與家蠶Bombyxmori蛹期特異因子Broad Complex(Br)相互作用(王永虎, 2013; Chengetal., 2014)。

BroadComplex(Br)是全變態(tài)昆蟲(chóng)蛹期蛻皮激素20E通路的初級(jí)響應(yīng)基因，對(duì)成功化蛹具有關(guān)鍵作用(Chengetal., 2014)。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中發(fā)現(xiàn)了Br-Z2/3(PxyBr-Z2/3)和Br-Z7(PxyBr-Z7)兩種異構(gòu)體，其中PxyBr-Z2/3是小菜蛾化蛹變態(tài)的主要調(diào)控基因(Huangetal., 2019; 胡曉漢等, 2021)。目前，RACK1在小菜蛾蛹期發(fā)育的功能及其對(duì)PxyBr-Z2/3的調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于小菜蛾基因組信息(Youetal., 2013)，克隆并測(cè)序了小菜蛾RACK1基因PxyRACK1完整開(kāi)放閱讀框，測(cè)定了PxyRACK1在不同發(fā)育階段的表達(dá)動(dòng)態(tài)，構(gòu)建了PxyRACK1的dsRNA原核表達(dá)體系，并利用顯微注射法探究了該基因的沉默對(duì)PxyBr-Z2/3基因表達(dá)及試蟲(chóng)化蛹的影響，以期為完整理解昆蟲(chóng)RACK1的功能及Br表達(dá)的影響因素提供資料，進(jìn)而為新型昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

供試蟲(chóng)源為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期室內(nèi)飼養(yǎng)的小菜蛾敏感種群，具體飼養(yǎng)方法參考韓藝欣等(2019)：幼蟲(chóng)寄主植物為蘿卜苗；幼蟲(chóng)化蛹后，收集蛹置于養(yǎng)蟲(chóng)籠中待羽化；成蟲(chóng)羽化后以10%(w/v)蜜糖水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)；取鮮嫩蘿卜苗(6 cm長(zhǎng))榨汁后，均勻涂于鋁箔錫紙(10 cm×10 cm)(購(gòu)自鄭州鴻富源工貿(mào)有限公司)供成蟲(chóng)產(chǎn)卵。飼養(yǎng)溫度為25±1℃，相對(duì)濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。

1.2 小菜蛾RACK1基因全長(zhǎng)克隆

參考天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取供試小菜蛾的總RNA，參考Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，合成5′RACE-ready和3′RACE-ready cDNA第1鏈。RACE擴(kuò)增采用Nested-RACE方法，以5′/3′ RACE-ready cDNA為模板，由NCBI登錄的RACK1基因(GenBank登錄號(hào): NP_001292436.1)設(shè)計(jì)特異引物，使用特異性引物和通用引物(UPM Mix和NUP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系(20 μL): cDNA(約1 000 ng/μL)1 μL, 正反向引物終濃度為10 μmol/L, dNTPs終濃度為0.25 μmol/L, Taq DNA Polymerase 2.5 U, 10×PCR Buffer(含2.5 mmol/L MgCl2) 2 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃ 2 min; 98℃ 10 s, 60℃ 1 min, 68℃ 2 min, 35個(gè)循環(huán)；最后68℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收并純化目的條帶，連接到pEAST-blunt質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化挑取陽(yáng)性克隆，送樣上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序后用DNAMAN軟件拼接核苷酸序列，獲得RACK1的基因序列全長(zhǎng)，并上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。登錄NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)，采用Blast程序與GenBank公布的生物序列進(jìn)行比較，并根據(jù)氨基酸序列分析其保守區(qū)域。同時(shí)，利用Lasergene軟件中的MegAlign程序以及MEGA 7.0軟件，與已知RACK1氨基酸序列進(jìn)行Cluster W法比對(duì)，鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 小菜蛾RACK1基因表達(dá)動(dòng)態(tài)測(cè)定

收集小菜蛾卵和1齡幼蟲(chóng)各100 mg，2齡幼蟲(chóng)20頭，3齡第1-2天幼蟲(chóng)、4齡第1-4天幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、1-4日齡蛹和成蟲(chóng)各5頭，每齡期樣品重復(fù)收集3次，分別提取總RNA。利用全式金生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒利用檢測(cè)合格的小菜蛾總RNA合成cDNA第1鏈。根據(jù)1.2節(jié)中克隆的序列分別設(shè)計(jì)特異性引物RACK1-QF/RACK1-QR(表1)，并選擇小菜蛾看家基因EF-1α為參照基因進(jìn)行qPCR反應(yīng)，內(nèi)參基因定量引物參考符偉等(2012)(表1)。qPCR反應(yīng)參考NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus (近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)體系(20 μL): cDNA(約1 000 ng/μL)1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各 0.4 μL, 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL, ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 3 min; 95℃ 6 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)測(cè)定3次，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.5 dsRNA合成

根據(jù)1.2節(jié)中克隆的小菜蛾P(guān)xyRACK1基因序列(GenBank登錄號(hào): MW160739)，并以pIZT/v5-his載體中GFP基因序列為陰性對(duì)照，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PxyRACK1 dsRNA擴(kuò)增引物RACK1-dsRNA-F/RACK1-dsRNA-R(5′端加上SacⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn))和GFPdsRNA擴(kuò)增引物GFP-dsRNA-F/GFP-dsRNA-R(5′端加上SacⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn))(表1)，引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

分別以預(yù)蛹期小菜蛾cDNA和pIZT/v5-his質(zhì)粒為模板，使用采購(gòu)自南京諾唯贊公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)?；靹蚋鹘M分并短暫離心后，進(jìn)行PCR反應(yīng): 95℃ 3 min; 95℃ 15 s, 59℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收并純化PCR產(chǎn)物后，取4 μL連接pEASY-Blunt Cloning載體以構(gòu)建pEASY-Blunt-PxyRACK1與pEASY-Blunt-GFP質(zhì)粒。

使用內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切構(gòu)建好的pEASY-Blunt-PxyRACK1質(zhì)粒和L4440空載體(由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所饋贈(zèng))及使用內(nèi)切酶SacⅠ和SalⅠ雙酶切 pEASY-Blunt-GFP質(zhì)粒及L4440空載體(酶切時(shí)間均為1 h)。酶切后將PxyRACK1和GFP片段分別與L4440載體片段用T4連接酶過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliHT115感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA，并將所表達(dá)的dsRNA純化，表達(dá)與純化方法參考王雪慶等(2018)。

1.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

挑取相同日齡、體型一致的4齡第2天小菜蛾幼蟲(chóng)用于RNA干擾實(shí)驗(yàn)，形態(tài)鑒定參考陳藝欣等(2011)。其中dsPxyRACK1處理組與dsGFP對(duì)照組各設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭試蟲(chóng)放入直徑15 cm玻璃培養(yǎng)皿中，注射劑量為100 nL(約1 000 ng/μL)。注射dsRNA 24 h 后，處理組與對(duì)照組各隨機(jī)選取5頭試蟲(chóng)并重復(fù)3次，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物Br-Z2/3-QF/Br-Z2/3-QR(表1)，以EF-1α為內(nèi)參基因，利用qPCR檢測(cè)PxyRACK1和PxyBr-Z2/3的表達(dá)。qPCR反應(yīng)體系參照1.4節(jié)。反應(yīng)程序: 94℃ 2 min; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)測(cè)定3次。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 RNAi的生物學(xué)效應(yīng)觀測(cè)

RNAi后，處理組和陰性對(duì)照組各取3個(gè)重復(fù)用于小菜蛾生物學(xué)觀測(cè)，每8 h觀察記錄試蟲(chóng)死亡數(shù)和化蛹數(shù)，計(jì)算死亡率、化蛹率和平均化蛹時(shí)間。 待小菜蛾化蛹后稱取蛹重。 死亡率=(死亡蟲(chóng)數(shù)/總試蟲(chóng)數(shù))×100%；化蛹率=(化蛹數(shù)/總試蟲(chóng)數(shù))×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)基因表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey氏檢驗(yàn)檢驗(yàn)基因相對(duì)表達(dá)量差異顯著性。RNAi的生物學(xué)效應(yīng)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)中，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)檢測(cè)RNAi效果。差異顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 PxyRACK1的克隆和序列

凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5′端片段條帶約為5 00 bp(圖1: A)，3′端片段條帶約為1 100 bp(圖1: B)，而中間片段PCR擴(kuò)增獲得大小約為1 000 bp的單一條帶(圖1: C)。上述電泳條帶經(jīng)回收純化并測(cè)序后，拼接得到1 148 bp基因片段。將測(cè)序的結(jié)果與已登錄的小菜蛾RACK1基因(GenBank登錄號(hào): NP_001292436.1)比對(duì)，結(jié)果顯示克隆基因序列全長(zhǎng)與目的基因序列一致性為98.40%，而其推導(dǎo)氨基酸序列一致性為100%，表明成功克隆小菜蛾P(guān)xyRACK1基因序列全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào): MW160739)，ORF長(zhǎng)960 bp，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)63 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)125 bp。編碼區(qū)共編碼319個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白大小為35.88 kD，等電點(diǎn)為7.677。預(yù)測(cè)的氨基酸序列中含有7個(gè)WD40重復(fù)序列，每個(gè)WD40重復(fù)序列含39～42個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 小菜蛾P(guān)xyRACK1的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增Fig. 1 Full-length cDNA amplification of PxyRACK1 of Plutella xylostellaM: 2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量 2k Plus DNA Marker; A: PxyRACK1的5′端片段的擴(kuò)增Amplification of the 5′end of PxyRACK1; B: PxyRACK1的3′端片段的擴(kuò)增Amplification of the 3′end of PxyRACK1; C: PxyRACK1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增Amplification of the encoding region of PxyRACK1. 1: PxyRACK1的5′端片段的擴(kuò)增產(chǎn)物Amplification product of the 5′end of PxyRACK1; 2: PxyRACK1的3′端片段的擴(kuò)增產(chǎn)物Amplification product of the 3′end of PxyRACK1; 3: PxyRACK1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物Amplification product of the encoding region of PxyRACK1.

圖2 小菜蛾P(guān)xyRACK1的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PxyRACK1 of Plutella xylostella圖中陰影標(biāo)示GH-WD基元，下劃線部分為7個(gè)WD40重復(fù)序列。The conserved GH-WD residues are marked in shade. Underlined amino acids are seven WD40 repeats.

2.2 小菜蛾P(guān)xyRACK1的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

比較分析不同生物的RACK1氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，小菜蛾P(guān)xyRACK1與其他物種的同源蛋白具有高度相似性，且所有物種的7個(gè)WD40重復(fù)序列的同源性均極高(圖3)。小菜蛾P(guān)xyRACK1氨基酸序列與同為鱗翅目昆蟲(chóng)的甜菜夜蛾Spodopteraexigua、煙芽夜蛾Heliothisvirescens、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera的RACK1序列一致性分別為98.70%, 98.10%和 98.10%，與同為昆蟲(chóng)綱但不同目的德國(guó)小蠊Blattellagermanica和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的RACK1序列一致性較低，分別為92.70%和86.80%， 而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的智人Homosapiens的RACK1序列一致性也達(dá)到78.20%(數(shù)據(jù)未顯示)?；诎被嵝蛄朽徑臃ń⒌南到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，鱗翅目昆蟲(chóng)的RACK1蛋白首先聚在一起，盡管RACK1蛋白在不同目昆蟲(chóng)之間存在一定差異，但總體而言昆蟲(chóng)RACK1蛋白進(jìn)化較為保守。

圖3 小菜蛾與其他物種RACK1蛋白的WD40重復(fù)序列比對(duì)Fig. 3 Sequence alignment of WD40 repeats of RACK1 proteins from Plutella xylostella and other speciesRACK1蛋白來(lái)源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species and GenBank accession numbers of RACK1 proteins: Bbe: 白樺尺蛾Biston betularia (ADO33039.1); Bge: 德國(guó)小蠊Blattella germanica (ABI63548.1); Bmo: 家蠶Bombyx mori (NP_001041703.1); Cfu: 云杉色卷蛾Choristoneura fumiferana (AAZ29605.1); Dme: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_001260218.1); Gga: 原雞Gallus gallus (NP_001004378.1); Har: 棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera (AEI84399.1); Hsa: 智人Homo sapiens (NP_006089.1); Mmy: 大鼠耳蝠Myotis myotis (KAF6349892.1); Obr: 冬尺蠖蛾Operophtera brumata (KOB78365.1); Ppo: 玉帶鳳蝶Papilio polytes (BAM18977.1); Pxu: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus (BAM17717.1); Pja: 日本對(duì)蝦Penaeus japonicus (AHF21001.1); Pxy: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella (NP_001292436.1); Rno: 褐家鼠Rattus norvegicus (NP_570090.2); Rph: 菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum (AWV55265.1); Sex: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (ABX55886.1); Hvi: 煙芽夜蛾Heliothis virescens (AAK51552.1); Vko: 科莫多巨蜥Varanus komodoensis (KAF7250119.1).

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的小菜蛾與其他物種的RACK1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig. 4 Phylogenetic tree of RACK1 of Plutella xylostella and other species constructed with neighbor-joining methodbased on the amino acid sequence (1 000 replicates)

2.3 小菜蛾P(guān)xyRACK1的表達(dá)動(dòng)態(tài)

qPCR結(jié)果表明，PxyRACK1在小菜蛾各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均可表達(dá)。以卵期表達(dá)量為參比，4齡第2天幼蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量最高(相對(duì)表達(dá)量1.32)，2日齡蛹中的相對(duì)表達(dá)量最低(相對(duì)表達(dá)量0.87)，但二者也僅相差1.5倍左右(P<0.05)；而4齡第4天幼蟲(chóng)(相對(duì)表達(dá)量0.96)、預(yù)蛹(相對(duì)表達(dá)量1.00)和4日齡蛹(相對(duì)表達(dá)量0.99)中的表達(dá)量則與卵期表達(dá)量相近(圖5)。

圖5 PxyRACK1在小菜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)譜Fig. 5 Expression profiles of PxyRACK1 at different developmental stages of Plutella xylostellaE: 卵Egg; L1-1: 1齡第1天幼蟲(chóng)Day-1 1st instar larva; L2-1: 2齡第1天幼蟲(chóng) Day-1 2nd instar larva; L3-1-2: 分別為3齡第1-2天幼蟲(chóng) Day-1-2 3rd instar larvae, respectively; L4-1-4: 分別為4齡第1-4天幼蟲(chóng) Day-1-4 4th instar larvae, respectively; PP: 預(yù)蛹Prepupa; P-1-4: 分別為1-4日齡蛹1-4 d-old pupae, respectively; A: 成蟲(chóng)Adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段之間差異顯著(P<0.05, Tukey氏檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, Tukey’s test).

2.4 RNAi后PxyRACK1的表達(dá)量變化

注射dsPxyRACK1 24 h后，小菜蛾4齡幼蟲(chóng)中PxyRACK1表達(dá)量顯著下降了36.26%(P<0.05)(圖6: A),而PxyBr-Z2/3表達(dá)量下降了83.46%(P<0.05)(圖6: B)。

圖6 RNAi干擾PxyRACK1 24 h后小菜蛾4齡幼蟲(chóng)中PxyRACK1(A)和PxyBr-Z2/3(B)的表達(dá)量Fig. 6 Expression levels of PxyRACK1 (A) and PxyBr-Z2/3 (B) in the 4th instar larvaeof Plutella xylostella at 24 h after RNAi of PxyRACK1圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示處理組與對(duì)照組(dsGFP注射組)之間差異顯著(P<0.05, 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the treatment group and the control group (dsGFP injected group) (P<0.05, independent samples T-test). 下同The same below.

PxyRACK1基因沉默后部分試蟲(chóng)停止取食，處理48 h后蟲(chóng)體逐漸變黑(圖7)，最終死亡。處理組化蛹高峰期推遲(圖8: A)，處理后64 h后處理組試蟲(chóng)死亡率達(dá)到最高并穩(wěn)定為46.66%，而注射GFPdsRNA的對(duì)照組試蟲(chóng)死亡率僅為6.67%(P<0.05) (圖8: B)。同時(shí)，64 h后對(duì)照組試蟲(chóng)平均化蛹率為93.33%，而處理組僅為43.33%(P<0.05) (圖8: C)；對(duì)照組平均化蛹時(shí)間為40.36 h，處理組則延長(zhǎng)至47.07 h(P<0.05)(圖8: D)；72 h后統(tǒng)計(jì)處理組和對(duì)照組平均蛹重，分別為4.727和5.327 mg(P<0.05)(圖8: E)。

圖7 分別注射dsGFP(A)和dsPxyRACK1(B)48 h后的小菜蛾4齡幼蟲(chóng)Fig. 7 The 4th instar larvae of Plutella xylostellaat 48 h after injection of dsGFP (A) anddsPxyRACK1 (B), respectively

3 討論

RACK1結(jié)構(gòu)的最大特點(diǎn)是含有7個(gè)由40個(gè)氨基酸殘基組成的WD40重復(fù)序列(WD1-WD7)基元，且多數(shù)基元的N端有一個(gè)甘基酸-組氨酸(GH)結(jié)構(gòu)，而C端有一個(gè)色氨酸-天冬氨酸(WD)結(jié)構(gòu)(段紅英等, 2007)。PxyRACK1的編碼區(qū)中也存在7個(gè)WD40重復(fù)序列，并且每個(gè)WD40重復(fù)序列均與其他物種的WD40重復(fù)序列高度相似(圖3)，證明了本研究所克隆的PxyRACK1編碼區(qū)的可靠性。重復(fù)的WD基元是RACK1與其他互作蛋白形成同源或異源二聚體的關(guān)鍵位點(diǎn)(Sklanetal., 2006)。RACK1正是通過(guò)其不同的 WD40位點(diǎn)與活化的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)結(jié)合后將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)位置，進(jìn)而調(diào)控特定生理生化過(guò)程(McCahilletal., 2002)。由于RACK1參與多個(gè)基本生物過(guò)程，涉及細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白合成等(Chang, 2002; Chenetal., 2006)，所以RACK1在小菜蛾生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中呈“看家基因式”表達(dá)。各測(cè)定時(shí)間表達(dá)水平雖然存在一定差異，但是總體差異不大(圖5)。也正因?yàn)樵摰鞍自谏矬w內(nèi)的重要性，其沉默后導(dǎo)致試蟲(chóng)死亡率顯著升高(圖8: B)。

圖8 注射PxyRACK1 dsRNA對(duì)小菜蛾的化蛹動(dòng)態(tài)(A)、死亡率(B)、平均化蛹率(C)、平均化蛹時(shí)間(D)以及平均蛹重(E)的影響Fig. 8 Effect of dsPxyRACK1 injection on the pupation dynamics (A), mortality (B), average pupation rate(C),average pupation time (D) and average pupal weight (E) of Plutella xylostella死亡率、化蛹時(shí)間和化蛹率均在顯微注射后64 h后測(cè)定，蛹重在顯微注射后72 h后測(cè)定。The mortality, pupation time and pupation rate were detected at 64 h after microinjection, and the pupal weight was measured at 72 h after microinjection.

在昆蟲(chóng)中，保幼激素(juvenile hormone, JH)通路和20E通路聯(lián)合調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程(Dubrovsky, 2005)。以往研究證實(shí)RACK1和這兩個(gè)通路之間存在關(guān)聯(lián)性。因?yàn)?0E能夠提高棉鈴蟲(chóng)6齡幼蟲(chóng)體內(nèi)RACK1的表達(dá)，而保幼激素類似物烯蟲(chóng)酯則能降低其表達(dá)(侯元春等, 2012)；利用RNAi技術(shù)和RACK1/PKC的專性抑制劑地喹碘銨(6CI,7CI)處理云杉卷葉蛾的CF-003細(xì)胞系均能抑制蛻皮激素通路轉(zhuǎn)錄因子CHR3的表達(dá)以及減少蛻皮激素受體(ecdysone receptor, EcR)在細(xì)胞核中的積累(Quanetal., 2006)。Br是全變態(tài)昆蟲(chóng)蛹期20E通路的早期響應(yīng)基因，研究也發(fā)現(xiàn)RACK1與Br存在相互作用。如在家蠶中不僅利用酵母雙雜交技術(shù)證實(shí)了相互作用的存在，而且還發(fā)現(xiàn)Br蛋白的磷酸化及其進(jìn)入細(xì)胞核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能也都離不開(kāi)RACK1的作用(王永虎, 2013; Chengetal., 2014)。在果蠅唾液腺中，RACK1沉默后，Br表達(dá)也降低(Wangetal., 2012)。類似地，本研究中也發(fā)現(xiàn)PxyRACK1基因沉默后，PxyBr-Z2/3基因表達(dá)水平顯著下降(圖6: B)。Br表達(dá)受阻后癥狀與過(guò)量JH影響相似(Spokony and Restifo, 2007; Duanetal., 2016)，表現(xiàn)為試蟲(chóng)死亡率升高、化蛹推遲、化蛹率下降以及蛹重減輕(圖8)。

綜合國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果，除20E外，全變態(tài)昆蟲(chóng)蛹期特異基因Br表達(dá)的影響因子至少包括JH、RACK1及全變態(tài)昆蟲(chóng)卵和低齡幼蟲(chóng)中的異時(shí)性通路(heterochronic pathway)關(guān)鍵基因hunchback和高齡幼蟲(chóng)的CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein, CBP)基因cbp(陳冀陽(yáng), 2020)。不過(guò)，有關(guān)各因素對(duì)Br表達(dá)的影響機(jī)制尚未完全明確。開(kāi)展這方面研究能夠?yàn)樘岣呋贐r表達(dá)調(diào)控改變害蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的提供有益借鑒，并能豐富新型昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)路徑。