綠豆象氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)分析

王宏民, 張 靜, 張 沖, 莊國(guó)動(dòng), 鄭海霞, 張仙紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 山西太谷 030801)

氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是一類小分子水溶性蛋白，大量存在于嗅覺系統(tǒng)的感器淋巴液中(Pelosietal., 2014, 2018)，在昆蟲的嗅覺識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用(Briandetal., 2001)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的鞘翅目昆蟲OBPs得到鑒定，如Liu等(2015)構(gòu)建了馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata觸角轉(zhuǎn)錄組，并鑒定出26個(gè)OBPs；胡軍等(2019)以蓮草直胸跳甲Agasicleshygrophila三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定出53個(gè)OBPs；李廣偉等(2017)在黃斑星天牛Anoplophoranobilis雌蟲觸角中共鑒定到16個(gè)OBPs；從其他昆蟲如松墨天牛Monochamusalternatus(Wangetal., 2014; Gao and Wang, 2015)、白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis(Mamidalaetal., 2013)、大猿葉甲Colaphellusbowringi(Lietal., 2015)、黃粉甲Tenebriomolitor(Liuetal., 2015)、中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae(Anderssonetal., 2013)等中也獲得多個(gè)OBPs。

根據(jù)OBPs氨基酸序列中半胱氨酸的數(shù)量和間距(Pelosietal., 2014)，可將其分為5種主要類型：(1)Classic OBPs：在昆蟲OBPs中占據(jù)多數(shù)，含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，第2個(gè)和第3個(gè)半胱氨酸殘基之間存在3個(gè)其他氨基酸殘基，第5個(gè)和第6個(gè)半胱氨酸殘基之間存在8個(gè)其他氨基酸殘基；(2)Dimer OBPs：具有兩組6個(gè)保守的半胱氨酸；(3)Plus-C OBPs：包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基、2個(gè)額外的半胱氨酸殘基和1個(gè)保守的脯氨酸(張治科等, 2017)；(4)Minus-C OBPs：缺失2個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)；(5)Atypical OBPs：C末端較長(zhǎng)，具有9～10個(gè)半胱氨酸殘基。大量研究表明，觸角是OBPs表達(dá)的重要部位，但在其他組織部位如頭、胸、腹等也有序表達(dá)(張治科等, 2017)，且由于昆蟲個(gè)體在不同性別、不同發(fā)育階段等情況下進(jìn)行的生命活動(dòng)不同，因此與其相關(guān)的OBPs的表達(dá)情況也會(huì)隨之變化。

綠豆象Callosobruchuschinensis屬鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchidae)瘤背豆象屬Callosobruchus，是一種分布廣泛且為害嚴(yán)重的害蟲種類，對(duì)綠豆、紅豆、豇豆等豆科植物種子造成嚴(yán)重的為害(王宏民等, 2017; 崔小林等, 2020)。由于綠豆象的幼蟲、蛹階段均隱蔽在種子內(nèi)而不利于防治，裸露的成蟲階段是進(jìn)行其防控的重要時(shí)期。因此在綠豆象成蟲尋找寄主植物和產(chǎn)卵部位的過(guò)程中，對(duì)其嗅覺識(shí)別進(jìn)行有效的干擾是降低其為害的重要手段。目前，有關(guān)OBP基因在綠豆象不同組織中表達(dá)的研究還未見報(bào)道。因此，本研究基于綠豆象觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和鑒定OBPs(鄭海霞等, 2018)的基礎(chǔ)上，對(duì)綠豆象部分OBP基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析及不同組織中的表達(dá)情況的研究，旨在為深入研究氣味結(jié)合蛋白在綠豆象嗅覺識(shí)別機(jī)制中的作用及基于嗅覺的綠豆象防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試綠豆象來(lái)源于室內(nèi)貯藏的綠豆種子中，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱(溫度27±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D)飼養(yǎng)至12代時(shí)備用。試蟲飼養(yǎng)方法：將綠豆平鋪在9 cm玻璃培養(yǎng)皿中，接入10對(duì)雌雄綠豆象成蟲，產(chǎn)卵1 d后取出成蟲，20 d左右取新羽化的綠豆象雌雄成蟲備用。

1.2 主要試劑

UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、即用PCR擴(kuò)增試劑盒(Taq)、DNA Marker(100(2 000 bp)、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、X-Gal、IPTG、SGExcel FastSYBR Master(含ROX)購(gòu)自上海生物工程有限公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMDTM19-T Vector Cloning Kit購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

切取羽化1 d的綠豆象成蟲(不分性別)觸角150對(duì)，提取RNA用于克隆實(shí)驗(yàn)。另外，切取羽化1 d的綠豆象成蟲頭部(不含觸角，雌雄各100頭)、觸角(雌雄各150頭)、翅(雌雄各80頭)、腹(雌雄各10頭)和足(雌雄各100頭)5種組織用于qRT-PCR。切取時(shí)盡量保證其組織的完整性，切取后迅速用液氮冷凍，置于-80℃冰箱備用。參照UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行提取，使用Biodrop Duo分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。利用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 綠豆象氣味結(jié)合蛋白基因的克隆

基于實(shí)驗(yàn)室前期的綠豆象成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，選擇Blast比對(duì)相似度較高的6條OBP序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。以1.3節(jié)合成的綠豆象成蟲觸角cDNA為模板，克隆綠豆象OBP基因的開放閱讀框序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL): PCR Mixture 12.5 μL, cDNA模板2.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL, 其余用水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, X℃(隨引物不同而調(diào)整)退火1 min, 72℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳， 將符合預(yù)期大小的目的條帶純化，并連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37℃培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性菌落送至測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 綠豆象氣味結(jié)合蛋白基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件翻譯測(cè)序成功的OBPs基因序列，并與其他昆蟲的OBP基因進(jìn)行序列比對(duì)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析。運(yùn)用NCBI-Conserved Domains工具預(yù)測(cè)OBPs的保守區(qū)域，在線工具ExPASy-ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行疏水性分析，SignalP 4.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽位置，利用MEGA7.0軟件采用鄰接法重復(fù)1 000次，構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)進(jìn)化樹(徐素平, 2014)。

1.6 綠豆象氣味結(jié)合蛋白的組織表達(dá)分析

基于1.4節(jié)克隆的6個(gè)CchiOBPs基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)，引物要求產(chǎn)物片段在80～250 bp之間。選擇最佳稀釋倍數(shù)稀釋雌雄各組織cDNA為模板，分別對(duì)6個(gè)CchiOBPs基因及內(nèi)參基因β-tubulin進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Mix 10 μL, cDNA模板0.8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 3 min; 95℃ 5 s, 58℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán)。以每個(gè)OBP在雌性腹部的表達(dá)量為基準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算6個(gè)CchiOBPs基因在每個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。每個(gè)組織測(cè)試3個(gè)重復(fù)樣品，每樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan氏多重極差檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)基因在相同性別不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)基因在相同組織不同性別的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 綠豆象OBP基因的克隆和命名

克隆獲得的綠豆象6個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因，參照Blast結(jié)果中序列相似度較高鞘翅目昆蟲OBP基因的命名方式，將綠豆象OBP基因依次命名為CchiOBP1-CchiOBP6，GenBnak登錄號(hào)分別為MN832700-MN832703和MN901841-MN901842，長(zhǎng)度分別為423, 432, 396, 441, 279和405 bp。

2.2 綠豆象OBP基因的序列特征和系統(tǒng)發(fā)育

綠豆象6個(gè)OBP基因均具有完整的開放閱讀框，分別編碼140, 143, 131, 146, 92和134個(gè)氨基酸，編碼蛋白分子量分別為15.40, 16.62, 14.69, 16.56, 10.37和15.02 kD，等電點(diǎn)分別為8.58, 8.32, 4.44, 8.60, 6.82和4.63。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CchiOBP1, CchiOBP2, CchiOBP3, CchiOBP4和CchiOBP6均含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，且第2個(gè)和第3個(gè)位點(diǎn)之間含有3個(gè)其他氨基酸殘基，屬于Classical OBPs; CchiOBP5經(jīng)比對(duì)分析后確定為部分序列，為一段C端不完整的Minus-C OBP。6個(gè)CchiOBPs在N端均具有信號(hào)肽。

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)克隆的綠豆象6個(gè)OBP基因進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果顯示CchiOBP1與榆藍(lán)葉甲Pyrrhaltaaenescens的PaenOBP17的氨基酸序列一致性最高，達(dá)56.03%；CchiOBP2與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata的LdecOBP72的氨基酸序列一致性最高，達(dá)69.29%；CchiOBP3與滅字虎天牛Xylotrechusquadripes的XquaOBP3的氨基酸序列一致性最高，達(dá)54.48%；CchiOBP4與松褐天牛Monochamusalternatus的MaltOBP4的氨基酸序列一致性最高，達(dá)62.70%；CchiOBP5與滅字虎天牛XquaOBP5的氨基酸序列一致性最高，達(dá)57.41%；CchiOBP6與云斑天牛Batocerahorsfieldi的BhorOBP3的氨基酸序列一致性最高，達(dá)38.84%。

系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)表明，7種葉甲科昆蟲、5種天?？评ハx、3種小蠹科昆蟲、2種象甲科昆蟲、1種穴甲科昆蟲、1種麗金龜科昆蟲、1種長(zhǎng)蠹科昆蟲和1種龍虱科昆蟲的OBPs分為4大分支。CchiOBP1和CchiOBP4聚為1大分支；CchiOBP3和CchiOBP6聚為1大分支；CchiOBP2和CchiOBP5各自單獨(dú)為1分支。聚為1支的CchiOBP1/CchiOBP4及CchiOBP3/CchiOBP6在進(jìn)化上距離較近，推測(cè)可能有相近或相似的功能；而單獨(dú)成支的CchiOBP2和CchiOBP5進(jìn)化上距離較遠(yuǎn)，可能行使不同的功能。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于綠豆象CchiOBP1-6與其他昆蟲OBPs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig. 1 Phylogenetic tree of CchiOBP1-6 of Callosobruchus chinensis and OBPs from other insect species constructedby the neighbor-joining method based on amino acid sequence (1 000 replicates)蛋白來(lái)源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 松墨天牛Monochamus alternatus (MaltOBP1: ABR53888.1; MaltOBP2: AJO67867.1; MaltOBP3: AHA39268.1; MaltOBP4: AHA39269.1; MaltOBP5: AHA39270.1; MaltOBP16: AIX97031.1); 滅字虎天牛Xylotrechus quadripes (XquaOBP3: AXO78381.1; XquaOBP4: AXO78382.1; XquaOBP5: AXO78383.1; XquaOBP7: AXO78385.1; XquaOBP8: AXO78386.1; XquaOBP10: AXO78388.1); 星天牛Anoplophora chinensis (AchiOBP: AUF72970.1, AUF72956.1, AUF72990.1, AUF72988.1, AUF72989.1); 云斑天牛Batocera horsfieldi (BhorOBP1: AHA33382.1; BhorOBP2: AHA33380.1; BhorOBP3: AHA33381.1; BhorOBP4: ADD82417.1); 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (AglaOBP3: ATO58974.1; AglaOBP13: ARH65468.1; AglaOBP14: ARH65469.1); 沙蔥螢葉甲Galeruca daurica (GdauOBP: AQY18970.1, AQY18974.1, AQY18977.1, AQY18993.1, AQY18972.1); 榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis (PmacOBP16: APC94207.1; PmacOBP17: APC94208.1; PmacOBP28: APC94187.1); 大猿葉蟲Colaphellus bowringi (CbowOBP1: ALR72489.1; CbowOBP2: ALR72490.1; CbowOBP20: ALR72508.1); 榆藍(lán)葉甲Pyrrhalta aenescens (PaenOBP16: APC94289.1; PaenOBP17: APC94290.1); 黃曲條跳甲Phyllotreta striolata (PstrOBP1: ANQ46500.1); 馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (LdecOBP72: XP_023028827.1); 玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera (DvirOBP19: XP_028135944.1); 中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae (DponOBP1: AKK25129.1; DponOBP16: AKK25140.1); 云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis (TyunOBP10: AMP19492.1)； 華山松大小蠹Dendroctonus armandi (DarmOBP3: ALM64965.1); 棕櫚象甲R(shí)hynchophorus ferrugineus (RferOBP9: ANE37553.1; RferOBP1: ANE37545.1); 香樟齒喙象Pagiophloeus tsushimanus (PtsuOBP33: QES69428.1); 花絨寄甲Dastarcus helophoroides (DhelOBP12: AIX97058.1; DhelOBP16: AIX97062.1; DhelOBP5: AIX97051.1); 銅綠麗金龜Anomala corpulenta (AcorOBP15: AKC58521.1); 谷蠹Rhyzopertha dominica (RdomOBP11: AIX97134.1); 黃邊大龍虱Cybister japonicus (CjapOBP2: AQM49875.1).

2.3 OBP基因的組織表達(dá)譜

qRT-PCR結(jié)果表明，綠豆象6個(gè)OBP基因在測(cè)定的綠豆象成蟲組織中均有不同的表達(dá)量(圖2)。雌成蟲中，CchiOBP1-CchiOBP4和CchiOBP6在觸角中的表達(dá)量最高，分別為在腹部中的183 076.0, 5 787.6, 2 399.9, 32 967.3和174.7倍，均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，且其他4種組織間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。CchiOBP5在雌成蟲觸角和頭部(不含觸角)中的表達(dá)量均較高，分別為腹部的5.1和4.2倍，且極顯著高在于翅、腹和足中的表達(dá)量(P<0.01)。

雄成蟲中，CchiOBP1-CchiOBP4在觸角中均高表達(dá)，分別為在腹部中的987.1, 1 043.3, 250.8和1 005.5倍，且與在其他4種組織中的存在極顯著差異(P<0.01)，但在這4種組織間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。CchiOBP5在足部的表達(dá)量最高，為腹部中的3.2倍，極顯著高于在其他組織中的(P<0.01)，其次為在頭部(不含觸角)中的，在觸角中的表達(dá)量最低，與頭部(不含觸角)表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.01)。CchiOBP6在觸角和足部的表達(dá)量也較高，分別為在腹部中的24.8和15.7倍，與在其他3個(gè)組織間表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。

綠豆象6個(gè)CchiOBPs基因在同一組織不同性別間的表達(dá)量存在差異。雄成蟲觸角、頭(不含觸角)、腹和足4個(gè)組織中CchiOBP1的表達(dá)量均顯著高于雌成蟲的(P<0.05)，分別是雌成蟲的2.8, 49.5, 511.0和54.6倍；在翅部的表達(dá)量顯著低于雌成蟲的(P<0.05)，是雌成蟲的0.07倍。雄成蟲觸角和翅中CchiOBP2的表達(dá)量顯著低于雌成蟲的(P<0.05)，分別是雌成蟲的0.3倍和0.2倍；在雄成蟲足部的表達(dá)量顯著高于雌成蟲足部的(P<0.05)，是雌成蟲的5.6倍；在頭部(不含觸角)和腹部的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。CchiOBP3基因在雌雄蟲間5個(gè)組織中的表達(dá)量均存在顯著差異(P<0.05)，在雄成蟲頭(不含觸角)、翅、腹和足中的表達(dá)量均顯著高于在雌成蟲中的(P<0.05)，分別是雌成蟲的8.6, 16.3, 3.8和17.0倍；在觸角中的表達(dá)量顯著低于雌成蟲的(P<0.05)，是雌成蟲的0.4倍。CchiOBP4在雄成蟲腹和足部的表達(dá)量顯著高于雌成蟲的(P<0.05)，分別是雌成蟲的12.1倍和9.2倍；在觸角和翅部的表達(dá)量顯著低于雌成蟲的(P<0.05)，均為雌成蟲的0.4倍；在頭部(不含觸角)的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。CchiOBP5在雄成蟲翅、腹和足部的表達(dá)量顯著高于雌成蟲的(P<0.05)，分別是雌成蟲的13.3, 4.8和6.1倍；在觸角中的表達(dá)量顯著低于雌成蟲的(P<0.05)，是雌成蟲的0.3倍；在頭部(不含觸角)的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。CchiOBP6在雄成蟲翅、腹和足部的表達(dá)量顯著高于雌成蟲的(P<0.05)，分別是雌成蟲的1.3, 5.6和7.2倍；在觸角和頭部(不含觸角)的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論

本研究以綠豆象觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，首次克隆出6個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因。序列分析表明，CchiOBP1-CchiOBP4和CchiOBP6均含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Classical OBPs, CchiOBP5一段缺少第3個(gè)和第4個(gè)半胱氨酸，推測(cè)為Minus-C OBP。與其他昆蟲OBPs序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，綠豆象CchiOBP1, CchiOBP2和CchiOBP5與葉甲科(Chrysomelidae)昆蟲OBPs的相似性較高，其中CchiOBP2與馬鈴薯甲蟲的LdecOBP72的氨基酸序列一致性高達(dá)69.29%，CchiOBP3,CchiOBP4和CchiOBP6與天?？?Cerambycidae)昆蟲OBPs的相似性較高。類似的結(jié)果，如黃斑星天牛的氣味結(jié)合蛋白AnobOBP14與松墨天牛的氣味結(jié)合蛋白MaltOBP4序列一致性高達(dá)85%(李廣偉等, 2017)，柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax的氣味結(jié)合蛋白BminOBP25氨基酸序列與桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的氣味結(jié)合蛋白BdorOBP的氨基酸序列一致性為88%(司品法等, 2018)，說(shuō)明近緣物種OBPs序列有較高的同源性，這些昆蟲的親緣關(guān)系較近。

基因的表達(dá)譜是預(yù)測(cè)基因功能的重要手段，谷少華(2013)認(rèn)為參與嗅覺識(shí)別的OBPs主要在觸角中特異性表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)的OBPs可能參與其他的生理功能。本研究中CchiOBP1,CchiOBP2,CchiOBP3,CchiOBP4和CchiOBP6在綠豆象雌雄成蟲觸角中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且顯著高于在其他組織中的，表明其對(duì)應(yīng)的5個(gè)CchiOBPs可能是參與綠豆象多種嗅覺識(shí)別過(guò)程的重要蛋白。研究表明，OBPs除了參與嗅覺識(shí)別外，還可能參與其他組織的生理功能，如味覺識(shí)別、食物中的脂肪酸溶解、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?張方梅等, 2019)。本研究結(jié)果顯示綠豆象部分OBP基因在觸角以外的組織中均有一定的表達(dá)量(圖2)，如CchiOBP1在雌成蟲頭部(不含觸角)和足部有較高的表達(dá)量，CchiOBP5在雌成蟲頭部(不含觸角)也高表達(dá)，而CchiOBP5在雄成蟲足部的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的，與前人報(bào)道的昆蟲足部也分布有味覺感器和嗅覺感器研究 (王娟, 2015; 楊葉青等, 2017; 張方梅等, 2019)一致，因此推斷CchiOBP1和CchiOBP5可能參與綠豆象除嗅覺之外的其他生理功能。此外，已克隆的6個(gè)基因在綠豆象翅和腹部的表達(dá)量均相對(duì)較低，說(shuō)明翅和腹部可能不是綠豆象CchiOBP行使功能的重要組織。

據(jù)報(bào)道，Minus-C OBPs與Classical OBPs相比，在不同組織中表達(dá)量差異較小(楊葉青等, 2017)。本研究表明，屬于Minus-C OBPs的CchiOBP5的基因在5個(gè)組織中的表達(dá)量差異較小，最大差異為雌成蟲觸角表達(dá)量是其腹部的5.1倍；而屬于Classical OBPs的5個(gè)CchiOBPs的基因則在不同組織中表達(dá)差異較大，在雌成蟲中尤為明顯，如CchiOBP1在雌成蟲觸角中的表達(dá)量是其在腹部表達(dá)量的183 076.0倍，頭(去除觸角)、翅和足組織中的表達(dá)量為其腹部中的18.0～79.6倍。

OBP基因在雌雄成蟲中普遍存在偏向表達(dá)，這可能與雌雄成蟲在生命活動(dòng)中各自承擔(dān)的角色不同有關(guān)，如甘薯蟻象的CforOBP8在雄成蟲翅部的表達(dá)量明顯高于在雌成蟲中的，推測(cè)這與雄成蟲在飛行中識(shí)別環(huán)境中的氣味、尋找配偶、交配等行為有關(guān)(賈小儉等, 2019)；橘小實(shí)蠅的BdorOBP19在雌成蟲觸角中大量表達(dá)，該基因在其產(chǎn)卵和定位寄主植物過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Wuetal., 2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，CchiOBP1在綠豆象雄成蟲各組織中的表達(dá)量顯著高于雌成蟲的，而CchiOBP2-CchiOBP5在雌成蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲的；除觸角外，其他部位的OBP基因表達(dá)量在雌雄成蟲間也存在一定差異。這些基因可能在雌雄之間交配時(shí)，或是與寄主互作的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，后期還需通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或RNA干擾等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。