BMP2與BMP4的基因多態(tài)性與難治性根尖周炎風險的相關性

熱孜亞·艾尼 馬依熱·阿布都賽麥提 陳曉濤

根尖周持續(xù)感染(persistent apical peridodontitis，PAP)作為慢性根尖周炎的一種臨床表現(xiàn)形式，雖然微生物的存在是PAP 發(fā)生的始動因子[1,2]，但在過去研究中，已經(jīng)表明遺傳多態(tài)性與炎癥和細胞活化相關分子的表達差異有關，故基因影響可有助于解釋多種疾病的易感[3,4]。且既往研究中證實[5,6]，RANKL、RANK、MMP1、MMP3 等基因的遺傳多態(tài)性可影響RAP的進展和治療反應。微生物代謝產(chǎn)物及其相關毒力因子誘導成骨細胞凋亡，造成骨細胞與破骨細胞動態(tài)平衡紊亂，影響RANKL、RANK、MMP1的等基因表達，不利于骨吸收和再生修復?？紤]到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4 可通過對破骨細胞相關因子的產(chǎn)生或強化作用而抑制破骨細胞分化過程，故本研究對BMP4 基因rs17563 位點、BMP2 基因rs1005464 和rs235768 位點基因型多態(tài)性與RAP的相關性進行探討，現(xiàn)報道如下。

1.資料及方法

1.1 一般資料 選取我院2018 年6 月至2020年8 月期間62 例根尖性牙周炎病變治療失敗需行顯微根尖外科手術治療的患者作為RAP組，RAP納入標準：(1)符合《牙體牙髓病學》中[7]關于RAP診斷標準；(2)患牙有根管治療史；(3)有竇道或竇道治療后未消失；(4)上前牙X 線片顯示根尖暗影最大直徑超過10mm。排除標準：(1)近期使用過全身抗生素治療者；(2)合并全身性疾病不耐受手術者；(3)存在根管側(cè)穿；(4)重度牙周病、牙根出現(xiàn)縱折。選取同期根尖性牙周炎病變治療后根部充實且根尖周圍健康的98 例作為對照組。醫(yī)院倫理委員會已批準本研究，患者及家屬簽署同意書。兩組一般資料(性別、年齡、是否吸煙等)對比P＞0.05，見表1。

表1 兩組一般資料比較(，n%)

1.2 方法

1.2.1 標本采集 收集所有試驗患者血液標本，采取1.5ml 靜脈血，加EDTA 二鈉抗凝，提取白細胞基因組DNA(以改良碘化鈉法)，其余置于醫(yī)用冰箱(-80℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性位點檢測(1)引物：由上海生物工程技術服務有限公司合成根據(jù)BMP4 基因(rs17563)、BMP2 基因(rs1005464、rs235768)的多態(tài)性設計序列特異性引物，所用引物詳見表2。(2)實時聚合酶鏈反應條件：所有基因PCR 反應體系體積20μL，DNA 模板量1μg，上、下游引物濃度均為1poml，10μL2×PCR 緩沖液，0.5μl dNTP，耐熱DNA 聚合酶和雙蒸水分別為0.5μl、18.5μl。(3)循環(huán)條件：①BMP4(rs17563 位點)：預變性2 min94℃，25 個循環(huán)，三步法(94℃、55℃、72℃分別為20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min，25℃反應終止；②BMP2(rs1005464 和rs235768 位點)：預變性90s94℃，25 個循環(huán)，三步法(94℃、55℃、72℃分別為20s、60s、20s)，最后72℃延伸10min；(4)PCR 產(chǎn)物電泳：于瓊脂糖凝膠(2%)將4μL 反應產(chǎn)物上樣，選擇適當恒壓，在緩沖液中以80V，20min 進行電泳，并對BMP4、BMP2 基因位點的基因型及等位基因頻率進行判讀。

1.3 觀察指標 比較兩組BMP4、BMP2 基因位點基因型及等位基因頻率，并采用邏輯回歸其與RAP 發(fā)生的相關性。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用(n%)表示，采用χ2檢驗；計量資料以()表示，采用獨立樣本t 檢驗；采用Logistic 進行相關性分析，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較 RAP 組rs235768 TT基因型頻率、rs235768 等位基因頻率中TT 高于對照組(P＜0.05)，兩組rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(P＞0.05)，見表3、表4。

表3 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(n%)

表4 BMP2 基因rs235768、rs1005464 位點基因型及等位基因比較(n%)

2.2 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?RAP 組C 基因型74.19%及頻率66.13%較對照組48.98%、37.24%高(P＜0.05)，見表5。

表5 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?n%)

2.3 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，C 基因型頻率顯著高于對照組(P＜0.05)，且C 等位基因頻率顯著高于對照組(P＜0.05)，見表6。

表6 兩組BMP4 基因rs17563 位點基因型及等位基因?qū)Ρ?n%)

2.4 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性與RAP的相關性分析 BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)和BMP4基因rs17563 位點CT 基因型及TT 基因型(OR=0.319，95%CI0.132～0.769；OR=0.196，95%CI0.087～0.444)分別是RAP 發(fā)生的保護因素和危險因素，見表7。

表7 BMP4、BMP2 基因多態(tài)性與RAP的相關性分析

3.討論

根管治療聯(lián)合顯微根尖外科手術是治療RAP的有效手段，但手術療效受牙齦切除，去骨，機體免疫，牙齒本身條件等因素限制，故探求RAP病因，根據(jù)病因選擇合理的治療方案十分必要。RAP 表現(xiàn)為復發(fā)性根尖周膿腫和進行性骨質(zhì)破壞，可導致牙槽骨缺損和牙齒喪失，是以淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等組成的炎性浸潤為主要特征，這些細胞可通過釋放促炎細胞因子來協(xié)助骨修復過程[8-9]。而骨修復通常由防御機制和病原體之間和/ 或牙髓治療后的自發(fā)平衡啟動，且涉及多個因素參與。BMP 為參與該過程的重要因子，從氨基酸序列上看，BMP 隸屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族，BMP2、BMP4 為BMP 中誘導成骨活性最強的因子，可促進牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生，由于BMP2、BMP4 在骨生物學中具有重要作用[10]，其可能參與RAP發(fā)生，故探討B(tài)MP2與BMP4的基因多態(tài)性與RAP 風險的相關性可為該疾病的治療提供一定理論依據(jù)。

BMP2 基因定位于20p12，屬于疏水性蛋白，主要由前體蛋白、信號肽和成熟結(jié)構(gòu)域組成，參與成骨性細胞分化、基質(zhì)合成與分泌。BMP2 作為影響骨組織形成的局部生長因子，可在骨形成早期，能募集未分化間質(zhì)細胞，向骨系細胞分化；還可通過增強成骨細胞內(nèi)的下游信號分子Smadl/ 5 和表基因Runx2的表達促使骨形成。Kang[11]、Jian[12]將含有rhBMP-2 基因的噬菌體轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細胞，在牙周膜干細胞的成骨細胞分化過程中，BMP2 具有一定調(diào)節(jié)作用。在骨吸收過程中，BMP2可能通過RANK、OPG 等系統(tǒng)干擾破骨細胞前體分化；Malik[13]表明Bmp2 在成牙本質(zhì)細胞組織中的作用，可為定向和組織化的牙齒礦化提供充足時間。本研究中，RAP 組TT 基因型45.16%、T 等位基因頻率63.71%均較對照組21.43%、57.14%高，Logistic 分析顯示，BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型(OR=3.370，95%CI1.325～8.574)是RAP危險因素，提示BMP2 基因rs235768C/ T多態(tài)性可能為RAP 發(fā)生的危險因素。BMP2 基因rs235768 位點攜帶T 等位基因會影響牙槽骨的吸收，這在既往已研究中得到證實[14]；Mitra 指出BMP2 rs235768 A＞T 可影響頜面、牙胚發(fā)育[15]；Dds ECK[16]等證實攜帶rs235768(BMP2)TT 基因型(雙絲氨酸突變體)持續(xù)性根尖周炎者患巴氏桿菌的風險是CC 基因型4 倍以上。這也在一定程度上說明BMP2 基因rs235768 多態(tài)性極大地增加RAP發(fā)生風險。

BMP4與BMP2 同屬于BMP 家族，與BMP2不同的是該基因定位于染色體14q22-q23，可通過對細胞增殖、分化等過程進行調(diào)節(jié)以控制成骨、破骨細胞，促進骨發(fā)育，且參與上頜突發(fā)育成上唇和繼發(fā)腭的過程。Bahrami 等[17]指出，BMP4 rs17563多態(tài)性可能是中國人和巴西人發(fā)展NSCLP的危險因素；Hao[18]的研究中rsl7563 位點CC 基因型是TT 基因型發(fā)生唇腭裂危險的1.612 倍，提示rsl7563 位點CC 基因型可能會影響口腔頜面部的發(fā)育。本研究多因素分析顯示，CT、TT 基因型是RAP 發(fā)生的保護因素(OR=0.319、OR=0.196)。出現(xiàn)這一結(jié)果可能與在高炎癥水平環(huán)境下，可抑制BMP4、Smad1/ 5 磷酸化水平，在一定程度上對牙髓干細胞的成牙/ 成骨分化能力造成影響[19,20]。而rs17563 是惟一位于編碼區(qū)域的SNP 位點，該位點普遍存在的高頻堿基轉(zhuǎn)換，可引起編碼蛋白纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，而兩者均為疏水氨基酸，纈氨酸的異丙基結(jié)構(gòu)較丙氨酸甲基大，多集中在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，T→C 錯義突變則會引起活性部位的結(jié)構(gòu)改變，進而使蛋白質(zhì)活性喪失，降低BMP4 水平表達，進而增加RAP 發(fā)生風險有關。

綜上所述，BMP2 和BMP4的基因多態(tài)性可參與RAP的發(fā)生，BMP2 基因rs235768 基因位點TT 基因型是RAP發(fā)生的危險因素，BMP4 基因rs17563 位點CT 基因型及TT 基因型是RAP 發(fā)生的保護因素。本研究不足之處在于選定基因的SNPs 數(shù)量有限，其具體影響機制尚需進一步研究，且樣本選取較為局限，今后可將選取不同地區(qū)、不同族群進一步驗證。