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    甘草次酸抑制幽門螺桿菌誘導的Th17炎性反應(yīng)研究

    2021-09-04 07:21:54于衛(wèi)華鄭倩婧馬翠空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心西安710032
    中南藥學 2021年8期
    關(guān)鍵詞:次酸螺桿菌幽門

    于衛(wèi)華,鄭倩婧,馬翠(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心,西安 710032)

    幽門螺桿菌是一種常見的革蘭氏陰性菌,具有很高的感染率[1],其感染主要發(fā)生在胃部黏膜中,存活時間較長,且不易根除,是引發(fā)人類慢性胃炎的重要病因之一,其中Th17 細胞免疫反應(yīng)等與幽門螺桿菌感染及病理反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。我國醫(yī)藥人員通過中醫(yī)藥方式治療幽門螺桿菌誘發(fā)的慢性胃炎病癥取得了顯著效果[4-5],然而由于中藥制劑成分復雜,其作用機制并不清楚。

    中藥甘草對于幽門螺桿菌的抑制和清除效果已有報道,其主要成分甘草次酸是一種已知的三萜類化合物,具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用[6-7]。本研究擬以幽門螺桿菌感染的慢性胃炎小鼠模型及體外Th17 細胞模型為研究對象,分析甘草次酸對幽門螺桿菌誘發(fā)慢性胃炎的作用及機制,為甘草治療慢性胃炎提供佐證。

    1 材料

    1.1 實驗動物與細胞

    SPF 級雄性C57Bl/6 小鼠,4 周齡,體質(zhì)量19 ~21 g [合格證號:SYXK(陜)2020-004,空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心];RAW 264.7 巨噬細胞由本中心實驗室保存;外周血單核細胞分離自正常小鼠。

    1.2 試藥

    甘草次酸(純度:98%,批號:G0149,Sigma公司);ELISA 試劑盒(Invitrogen 公司);WST-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);流式細胞儀(Becton-Dickinson 公司);青霉素/鏈霉素(批號:15140148)、胎牛血清(FCS,批號:26400044)、RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號:C11875500BT)(Gibco公司);anti-CD28 抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司);anti-CD3 抗體(Abcam 公司);重組鼠BAFF(rBAFF)(Enzo Life Sciences 公司);BAFF 抗體(Adipogen 公司)。

    2 方法

    2.1 小鼠模型制備與處理

    采用幽門螺桿菌感染法制備小鼠模型[8]。CagA+/VacA+幽門螺桿菌株接種于含5%FCS 的布魯氏肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)2 d。將0.5 mL 幽門螺桿菌懸液(1×108菌·mL-1)用鋼導管接種于C57Bl/6 小鼠(6 周齡)胃部,繼續(xù)喂養(yǎng)4 周,制備模型。

    模型小鼠隨機分為模型組和處理組,每組8只。處理組:小鼠每日尾靜脈注射甘草次酸懸液(8.0 mg·kg-1),持續(xù)1 周;模型組:注射等量生理鹽水;另設(shè)未處理的正常小鼠為對照組(8只)。各組末次給藥后禁食24 h,斷頭處死,剖腹取胃,收集胃黏膜組織,使用PBS 緩沖液對胃黏膜組織進行沖洗后,按1 g 組織加9 mL PBS 勻漿液對組織勻漿,進行后續(xù)檢測。

    2.2 細胞培養(yǎng)與處理

    RAW 264.7 巨噬細胞于37℃條件下培養(yǎng)于含10%FCS、100 U·mL-1青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。采用密度梯度離心法自正常小鼠外周血分離獲得外周血單核細胞,然后通過磁性細胞分選試劑盒從其中分離純化出CD4+T 細胞(純度達93%以上),培養(yǎng)于含10% FCS 和青霉素/鏈霉素(100 U·mL-1)的RPMI 1640 培養(yǎng)基中;將單核細胞于含IL-4(50 ng·mL-1)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(100 ng·mL-1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d,每3日更換新鮮培養(yǎng)基,收集獲得DC 細胞;將CD4+T 細胞培養(yǎng)液中添加0.1 μg·mL-1anti-CD28、0.5 μg·mL-1anti-CD3 抗體,共培養(yǎng)3 d 后收集獲得Th17 細胞。上述獲得的Th17 細胞、巨噬細胞、DC 細胞、CD4+T 細胞分別與幽門螺桿菌(MOI =0.5)于37℃共培養(yǎng)12 h,更換新鮮培養(yǎng)基,加入75 ng·mL-1甘草次酸(DMSO 溶解后使用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度)培養(yǎng)24 h,收集上清液進行后續(xù)分析。各細胞懸液中加入rBAFF(50 ng·mL-1)或BAFF 抗體(1 μg·mL-1)培養(yǎng)24 h,收集上清液進行檢測,評價BAFF 功能。

    2.3 ELISA 試劑盒法檢測炎性因子

    采用ELISA 試劑盒法分別檢測各組小鼠胃黏膜組織或培養(yǎng)的細胞上清液中IL-6、TGF-β、IL-1β、IL-10、IL-17、BAFF 因子水平。

    2.4 流式細胞術(shù)檢測

    CD4+T 細胞處理24 h 后,調(diào)整細胞密度至1×106個·mL-1,加入FITC-IL-17 抗體染色,進行流式細胞分析。

    2.5 統(tǒng)計分析

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組比較用t檢驗,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    3 結(jié)果

    3.1 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎小鼠炎性因子水平的影響

    與對照組相比,模型小鼠胃黏膜組織中及幽門螺桿菌感染的巨噬細胞上清液中促Th17 炎性因子IL-6、TGF-β、IL-1β水平均顯著升高,而抑炎因子IL-10 水平則明顯降低(P<0.01),見圖1;與模型組相比,甘草次酸處理組中IL-6、TGF-β、IL-1β水平則明顯下降,IL-10 水平顯著上升(P<0.05,P<0.01)。

    圖1 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎中炎性因子的影響Fig 1 Effect of glycyrrhetinic acid on the inflammatory factor in H.pylori-induced chronic gastritis

    3.2 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎中Th17 細胞反應(yīng)水平的影響

    與對照組相比,模型小鼠胃黏膜組織及幽門螺桿菌感染的CD4+T 細胞上清液中IL-17 水平均顯著升高(P<0.01);與模型組相比,處理組中IL-17 水平則明顯下降(P<0.01),見圖2;同時處理組CD4+T 細胞中IL-17+細胞占比也較模型組顯著減少(P<0.01)。

    圖2 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎中Th17 細胞反應(yīng)的影響Fig 2 Effect of glycyrrhetinic acid on Th17 in H.pylori-induced chronic gastritis

    3.3 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎中BAFF 因子表達的影響

    與對照組相比,模型小鼠胃黏膜組織中及幽門螺桿菌感染的DC 細胞、CD4+T 細胞上清液中BAFF 因子水平均顯著升高;與模型組相比,處理組中BAFF 因子水平則明顯下降(P<0.01),見圖3。

    圖3 甘草次酸對幽門螺桿菌誘導的慢性胃炎中BAFF 因子的影響Fig 3 Effect of glycyrrhetinic acid on BAFF in H.pylori-induced chronic gastritis

    3.4 甘草次酸對BAFF 誘導的促Th17 因子的影響

    在幽門螺桿菌感染的巨噬細胞和單核細胞中,重組rBAFF 處理可顯著上調(diào)促Th17 因子IL-6、TGF-β、IL-1β水平,相反BAFF 單抗處理則會下調(diào)其水平(P<0.05),見圖4;甘草次酸對促Th17 因子的抑制作用可被rBAFF 削弱,被BAFF 單抗處理加強(P<0.05)。

    圖4 甘草次酸對BAFF 誘導的促Th17 因子的影響Fig 4 Effect of glycyrrhetinic acid on pro-Th17 cytokines induced by BAFF

    4 討論

    甘草次酸為中藥材甘草的主要成分之一,屬于三萜化合物的一種[9]。研究表明,甘草在傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療慢性胃炎及其他消化系統(tǒng)類疾病中發(fā)揮著重要作用,其中甘草次酸等成分在幽門螺桿菌等胃腸道病原菌的抑制作用中扮演著關(guān)鍵角色[10-12],然而,其在幽門螺桿菌誘發(fā)的慢性胃炎中的藥理作用及調(diào)控機制鮮有報道。本實驗從T細胞免疫反應(yīng)的角度探討了甘草次酸對幽門螺桿菌感染引發(fā)的炎性反應(yīng)的作用機制。

    T 細胞免疫反應(yīng)有助于清除細菌引發(fā)的組織感染癥狀,其中Th1 型反應(yīng)即與幽門螺桿菌相關(guān)疾病有關(guān),這類細胞反應(yīng)負責清除細菌,同時也會造成受感染組織發(fā)生損傷[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn),Th17 細胞免疫反應(yīng)也與幽門螺桿菌感染有關(guān)[14]。Th17 是能分泌IL-17 炎性因子的輔助性T 細胞,由CD4+T 細胞分化而來。然而Th17 細胞與Th1反應(yīng)相反,其有利于細菌的生長,從而加速了幽門螺桿菌感染引起的病理反應(yīng)[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染后,CD4+T 細胞向Th17 細胞分化頻率增加,胃黏膜中IL-17 分泌量增加,而甘草次酸則能顯著抑制Th17 細胞的活化和IL-17 的產(chǎn)生。

    B 細胞活化因子BAFF 是來源于TNF 家族的關(guān)鍵細胞因子,多由單核細胞、樹突狀細胞分泌合成,在B 細胞的生存和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[18]。BAFF 可由幽門螺桿菌誘導表達,Munari 等[19]研究發(fā)現(xiàn)BAFF 在幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜中高度表達。既往證據(jù)表明,高表達的BAFF 也是Th17 細胞產(chǎn)生和分化的關(guān)鍵促進因子[20]。BAFF 能激活單核細胞、樹突狀細胞中TGF-β、IL-1β炎性因子的產(chǎn)生,而后者對于Th17細胞的誘導分化具有顯著促進作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn),在幽門螺桿菌感染的小鼠和體外DC 細胞、CD4+T 細胞上清液中BAFF 因子均呈高水平表達態(tài)勢,而甘草次酸則能明顯降低BAFF 水平,并可減少幽門螺桿菌感染的巨噬細胞和單核細胞中BAFF 誘導的促Th17 因子IL-6、TGF-β、IL-1β的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抑制Th17 細胞反應(yīng)的作用。

    綜上所述,本文以幽門螺桿菌感染的慢性胃炎小鼠模型及體外Th17 細胞模型為研究對象,證實了甘草次酸對幽門螺桿菌誘發(fā)慢性胃炎中Th17 細胞反應(yīng)具有抑制作用,其機制可能與甘草次酸抑制BAFF 炎性因子的產(chǎn)生及減少促Th17因子的產(chǎn)生作用有關(guān)。該結(jié)果為中藥甘草及甘草次酸用于慢性胃炎的治療提供了實驗依據(jù)。

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