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    人參皂苷Rh3聯(lián)合多西他賽抑制PC3腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲

    2021-09-04 07:21:54孟佳佳王丹丹王陳萍南通市第三人民醫(yī)院臨床藥學部江蘇南通226003
    中南藥學 2021年8期
    關鍵詞:皂苷人參批號

    孟佳佳,王丹丹,王陳萍(南通市第三人民醫(yī)院臨床藥學部,江蘇 南通 226003)

    前列腺癌(prostate cancer,PCa)是常見的男性泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤,在西方國家中PCa 位居男性新發(fā)惡性腫瘤的第1 位,病死率在惡性腫瘤中居第3 位[1]。我國PCa 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,已成為我國男性常見的惡性腫瘤之一[2]。目前對PCa 缺乏安全有效的治療措施。

    多西他賽(docetaxel)屬于第二代紫杉醇類化療藥物,能減輕PCa 患者的癥狀,提高生存率和生活質(zhì)量,但其產(chǎn)生的不良反應和耐藥性不可忽視[3]。然而,在治療PCa 中,多西他賽與藥物最佳聯(lián)合及最小不良反應的治療方案仍然缺乏。

    人參在中國已有數(shù)千年的食用和藥用歷史,經(jīng)常被用于預防和治療多種疾病,是非常寶貴的補品。人參皂苷是人參的主要藥理活性成分,因其廣泛的生物活性而聞名。人參皂苷有幾種不同的化合物,包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3等。 其中最常研究的人參皂苷為Rg3、Rg1、Rb1、Rh1、Re 和Rd[3]。有研究表明,某些人參皂苷,例如Rg1、Rg2、Rg3和Rh2具有誘導凋亡,抑制增殖或抑制遷移的抗腫瘤活性[4-5]。由于人參皂苷Rh3是稀有的人參皂苷之一,因此對其生物活性了解甚少。

    本研究旨在評價人參皂苷Rh3聯(lián)合多西他賽化療對PC3 前列腺腫瘤細胞的細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

    1 材料

    1.1 腫瘤細胞

    人前列腺癌細胞PC3(中國科學院上海細胞庫),復蘇后接種于F-12K 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液組成的培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2 儀器

    酶標儀(德朗公司,DR-200Bs);細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司,150iC02);生物凈化工作臺(蘇州蘇潔凈化設備公司,VS-1300U);離心機(德國Eppendorf 公司,5424r);4℃、-20℃和80℃超低溫冰箱(海爾公司);移液器(德國Eppendorf 公司);顯微鏡(OPTEC 公司,TP510);電泳槽(北京百晶生物,BG-transBLOT);Transwell小室(353097,F(xiàn)alcon),細胞培養(yǎng)瓶(Corning 公司,25 cm2);培養(yǎng)皿(Corning 公司,100 mm2),1.5 mL EP 管(AXYGEN,MCT-150-C)。

    1.3 試藥

    多西他賽(批號:D107320,規(guī)格:10 mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),人參皂苷Rh3(批號:89007,規(guī)格:20 mg,北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司),WST-1 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(批號:C0036,碧云天生物技術有限公司),Matrigel(批號:354234,BD),結(jié)晶紫染色液(批號:C0121)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(批號:P0012S)、HRP 標記二抗(批號:A0201)(碧云天生物技術有限公司),E-cadherin 抗體(批號:20874-1,00082672,Proteintech),N-cadherin 抗體(批號:A01577-2,15D39,博士德),GAPDH 抗體(批號:60004-1,0004237,Proteintech)。

    2 方法

    2.1 細胞活力檢測

    使用WST-1 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒分別檢測人參皂苷Rh3和多西他賽對PC3 細胞活力的影響。在96 孔板每孔加入100 μL(2000個)PC3 細胞,人參皂苷Rh3實驗組分別加入0、5、10、20、40、80、160 和320 μmol·L-1人參皂苷Rh3[6-7];多西他賽實驗組分別加入0、1、2、4、8、16、32 和64 nmol·L-1的多西他賽(用二甲基亞砜配制)[8-9]。0 濃度組為陰性對照組,加入等體積溶劑。培養(yǎng)24 h 后,每孔加入10 μL WST-1 溶液,孵育2 h,把96 孔板置于搖床上搖動1 min,在450 nm 測定吸光度(A值)。細胞增殖抑制率 =(1-實驗組平均A值/陰性對照組平均A值)×100%。

    2.2 細胞劃痕方法

    PC3 腫瘤細胞常規(guī)方法擴增細胞數(shù)量,用胰酶消化,制備1×106個·mL-1細胞懸液,將500 μL 細胞懸液加入預先放置隔板的24 孔板中,實驗分為對照組、人參皂苷Rh3組(Rh3組,10 μmol·L-1)、多西他賽組(Doc 組,2 nmol·L-1)、人參皂苷Rh3和Doc 聯(lián)合用藥組(Rh3+Doc組),細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h,取出隔板,拍攝所形成劃痕的初始寬度。加入干預藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h 和48 h 后拍攝劃痕寬度。

    2.3 細胞侵襲實驗-Transwell 法

    同“2.2”項下方法分組,用預冷的基礎培養(yǎng)基稀釋Matrigel,并取40 μL 加入預冷的Transwell 小室中;將PC3 腫瘤細胞制成2×105個·mL-1含干預藥物的單細胞懸液,取200 μL體積細胞懸液加入Transwell 小室。下室加入500 mL 完全培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室,4%多聚甲醛溶液固定25 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,晾干后包被基底膜,顯微鏡拍照后進行細胞記數(shù)。

    2.4 Western blot 法

    同“2.2”項下方法分組,收集各組細胞,提取總蛋白質(zhì),用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。制備電泳膠,在上樣孔加入10 μL 蛋白和蛋白電泳marker,電泳并轉(zhuǎn)PVDF 膜,封閉后。分別加E-cadherin 抗體(1∶10 000),N-cadherin 抗體(1∶1000),GAPDH 抗體(1∶20 000),孵育過夜,繼續(xù)孵育HRP 標記的二抗,HRP-ECL 發(fā)光法進行分析并掃描。

    2.5 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析,計量資料用±s表示,組間差異比較采用方差分析或t檢驗,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

    3 結(jié)果

    3.1 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細胞增殖

    人參皂苷Rh3和多西他賽處理PC3 細胞24 h的細胞增殖抑制率,結(jié)果見表1。隨著人參皂苷Rh3、多西他賽的濃度增大,PC3 細胞增殖抑制率逐漸升高。根據(jù)濃度梯度和細胞抑制率結(jié)果,后續(xù)實驗Rh3和多西他賽分別選擇10 μmol·L-1和2 nmol·L-1濃度進行處理。

    表1 人參皂苷Rh3 和多西他賽對PC3 細胞增殖抑制率(24 h)Tab 1 Inhibition rate of PC3 cell proliferation by ginsenoside Rh3 and docetaxel (24 h)

    3.2 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細胞遷移

    劃痕法測細胞的遷移能力結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示,細胞愈合24、48 h,與對照組比較,人參皂苷Rh3組和多西他賽組明顯抑制PC3 細胞遷移(P<0.05,P<0.01),兩者聯(lián)合處理效果更佳(P<0.01)。

    圖1 人參皂苷Rh3 和多西他賽對PC3 細胞遷移的影響(100×)Fig 1 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on PC3 cell migration(100×)

    3.3 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細胞侵襲

    通過Transwell 法測細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示,人參皂苷Rh3和多西他賽組PC3 細胞數(shù)量明顯少于對照組,表明人參皂苷Rh3和多西他賽明顯抑制細胞侵襲(P<0.05),聯(lián)合處理組效果更好(P<0.01)(見圖2)。

    圖2 人參皂苷Rh3 和多西他賽對PC3 細胞侵襲的影響(100×)Fig 2 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on the invasion of PC3 cells (100×)

    3.4 人參皂苷Rh3 和多西他賽抑制PC3 腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

    E-cadherin 為上皮標記蛋白,N-cadherin 為間質(zhì)標記蛋白,通過Western blot 法檢測兩者表達水平,進一步說明腫瘤細胞的遷移和侵襲能力及其分子機制。結(jié)果顯示,人參皂苷Rh3和多西他賽均能上調(diào)E-cadherin 蛋白表達水平和下調(diào)N-cadherin 蛋白表達水平(P<0.05),兩藥聯(lián)用作用效果更為顯著(P<0.01)(見圖3)。

    圖3 人參皂苷Rh3 和多西他賽對PC3 細胞上皮-間質(zhì)關鍵蛋白E-cadherin 和N-cadherin 表達水平的影響Fig 3 Effect of ginsenoside Rh3 and docetaxel on the expression of E-cadherin and N-cadherin in PC3 cells

    4 討論

    PCa 是臨床泌尿外科常見的惡性腫瘤,中晚期PCa 的發(fā)病率逐年升高。多數(shù)PCa 患者確診時已為中晚期,經(jīng)過內(nèi)分泌治療后,逐漸發(fā)展為去勢抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),化療是CRPC 的重要治療手段[9]。紫杉類藥物被認為是治療PCa 最有效的化療藥物。多西他賽為紫杉醇的半合成衍生物,雖然已廣泛應用于PCa 患者的輔助化療和CRPC 的治療[10],但絕大多數(shù)患者在用藥過程中出現(xiàn)藥物耐藥現(xiàn)象和不良反應[5,11]。因此,尋求一種新的有效的治療PCa 方法是有必要的。

    人參皂苷是人參中最重要和最主要的藥理活性成分,研究表明,人參皂苷Rg1、Rg2、Rg3和Rh2具有誘導細胞凋亡、抑制增殖或抑制遷移的抗腫瘤活性[3,12]。人參皂苷Rh3在人參屬藥材中含量很低,為稀有的人參皂苷,但其制備工藝已得到大幅提升,為人參皂苷Rh3的研究和應用提供了極大地便利[13]。

    人參皂苷Rh3通過抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)活性、增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達和cAMP 反應元件結(jié)合蛋白激活來保護記憶受損[14]。人參皂苷Rh3通過調(diào)節(jié)5′-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶信號通路在小膠質(zhì)細胞中發(fā)揮抗炎作用[15]。它通過激活Nrf2 來保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免受紫外線的傷害[16]。人參皂苷Rh3可以抑制紫外線照射角質(zhì)形成的細胞中GMCSF 表達[17]。人參皂苷Rh3具有良好的抗腫瘤活性。在白血病中,人參皂苷Rh3使HL-60 細胞周期阻滯在G1/S 期,并誘導細胞分化為形態(tài)和功能性的粒細胞[18]。人參皂苷Rh3能夠抑制人結(jié)腸癌細胞和卵巢癌細胞增殖并促進細胞凋亡[5,19]。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rh3能夠明顯抑制PC3 細胞的增殖、遷移和侵襲。表明人參皂苷Rh3是一種潛在的抗PCa 細胞侵襲的藥物。人參皂苷Rh3抑制N-cadherin 表達,促進了E-cadherin 表達,表明其可能抑制了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT 在生命正常發(fā)育的各個階段以及在腫瘤細胞發(fā)生的一系列表型和分子變化中非常常見[20]。對于許多腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移而言,EMT 是關鍵的早期事件,而E-cadherin 的表達下調(diào)則是 EMT的標志之一[20-21]。E-cadherin 轉(zhuǎn)錄表達抑制受很多因素影響,包括鋅指蛋白的Snail/Slug 家族、Twist、ZEB1、SIP1 等因子[22]。因此,人參皂苷Rh3抑制PC3 腫瘤細胞遷移和侵襲的上游調(diào)控分子機制是后期研究的方向。

    綜上,人參皂苷Rh3可能通過調(diào)節(jié)EMT 過程抑制PCa 細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力,臨床治療中,人參皂苷Rh3不論是單獨使用或聯(lián)合化療藥物使用均具有應用前景。但是,由于本研究限于PCa 細胞的體外結(jié)果,后期還需要進行深入的分子機制研究,為人參皂苷Rh3運用于PCa 臨床治療打下堅實的基礎。

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