基于鈣敏感受體分子表達(dá)水平探討大鼠脂肪組織胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制

闞玉娜，謝佳明，簡白羽，馬立威，陳哲，王文豹，劉吉成*（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱50040；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 6006）

糖尿病（DM）是一種常見的代謝性疾病，其特征是血糖水平異常升高，這可能會導(dǎo)致多系統(tǒng)并發(fā)癥，包括糖尿病性酮癥酸中毒，腎衰竭，心血管損害甚至死亡。2015年，全世界約有4.15億人患有糖尿病，到2040年，預(yù)計(jì)將超過6.4億[1]，90%為2 型糖尿?。═2DM）[2]。胰島素抵抗（IR）是T2DM 的主要原因，是指其靶細(xì)胞對胰島素敏感性降低或喪失，導(dǎo)致葡萄糖耐受性降低，動脈高血壓，以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂，最終導(dǎo)致多種并發(fā)癥，例如非酒精性脂肪肝疾病、心血管疾病和代謝紊亂[3-4]。因此，改善IR已成為治療T2DM 的主要策略。IR 是推動T2DM發(fā)生的重要機(jī)制，在生理?xiàng)l件下，胰島素刺激葡萄糖進(jìn)入肝臟，骨骼肌和脂肪組織維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，IR 時(shí)胰島素?zé)o法激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)脂質(zhì)吸收，并抑制脂肪分解。

磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，主要調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、β細(xì)胞存活、胰島素基因轉(zhuǎn)錄等過程，該通路障礙都會導(dǎo)致IR[5]。胰島素與胰島素受體（InsR）結(jié)合時(shí)，胰島素受體底物（IRS）酪氨酸磷酸化后被激活，隨后激活PI3K/AKT 信號通路，參與胰島素的代謝調(diào)節(jié)[6]。

鈣敏感受體（CaSR）是不可或缺的膜蛋白，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族。CaSR 可在脂肪組織中表達(dá)[7]，CaSR 激動劑使AKT 活性顯著增強(qiáng)，其抑制劑可抑制AKT 活性[8]。當(dāng)CaSR 被激活時(shí)，可以使PI3K/Akt 信號通路激活，提示CaSR 與PI3K/Akt 信號通路密切相關(guān)[9]。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar 雄性大鼠48 只，體質(zhì)量（200±20）g[黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號編號：SCXK（魯-2009-0007）]。分籠飼養(yǎng)，房間溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，空氣新鮮，通風(fēng)良好，按時(shí)更換墊料，不限制攝食和飲水。

1.2 試藥

膽固醇、果糖、蔗糖和谷氨酸鈉（上海惠世生化試劑有限公司）；丙硫氧嘧啶（美國Sigma 公司）；Tween 80（天津市進(jìn)豐化工有限公司）；丙二醇（天津市化學(xué)試劑六廠）；葡萄糖（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）；75%乙醇（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；苦味酸（西隴化工股份有限公司）；甲醛（天津永晟精細(xì)化工有限公司）；二甲苯、無水乙醇、鹽酸（北京化工廠）；氨水（西隴科學(xué)股份有限公司）；低熔石蠟、高熔石蠟（上海華永石蠟有限公司）；ELISA 試劑盒（南京生物試劑公司）；Trizol Reagen（Invitrogen 公司）；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix 試劑盒（Bioneer 公司）；蛋白裂解液（碧云天生物有限公司）；蛋白預(yù)染Marker（美國Thermo 公司）；CaSR、β-actin 抗體（美國Abcam 公司）；AKT、p-AKT（S473）、p-AKT（T308）抗體（美國CST 公司）。

1.3 儀器

梯度PCR 儀（Bio-RAD S1000）、Real-time PCR 儀（Bio-RAD CFX96）、電泳儀（Bio-RAD）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RAD）、Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ）；微量臺式低溫離心機(jī)（Thermo 有限公司）；紫外分光光度計(jì)（日本島津有限公司）。

2 方法

2.1 分組與建模

脂肪乳的制備：豬油（20%）、膽固醇（5%）、蔗糖（5%）、果糖（5%）、丙硫氧嘧啶（1%）、谷氨酸鈉（1%）、食用鹽（6%）、Tween 80（20%）和丙二醇（30%）配成脂肪乳。

雄性Wistar 大鼠48 只，隨機(jī)分為模型組和空白組，每組24 只，于第2、4、6、8 周分別處死6 只。模型組大鼠灌胃脂肪乳（10 mL·kg－1），1 次·d－1，空白組灌胃等量蒸餾水。

2.2 觀測指標(biāo)與標(biāo)本采集

2.2.1 大鼠一般情況觀察 觀察大鼠行為表現(xiàn)，測量體質(zhì)量。

2.2.2 空腹血糖（FBG） 各組大鼠末次灌胃脂肪乳后禁食，不禁水，12 h 后經(jīng)尾靜脈取血，用血糖儀測定大鼠FBG。

2.2.3 空腹胰島素（FINS） 將動物麻醉后，腹主動脈取血4 mL， 靜置30 min，4℃、3500 r·min－1離心15 min 后，取上清液1 mL，－20℃保存，按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測。根據(jù)FBG 和FINS 的值，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI）：ISI ＝ln[1/（FBG×INS）]。

2.2.4 免疫組化檢測脂肪組織CaSR 表達(dá) 將經(jīng)多聚甲醛固定液浸泡的大鼠脂肪組織標(biāo)本，切成2 mm×3 mm×4 mm 大小的組織塊，用0.1 mmol·L－1PBS 漂洗后，使用不同濃度乙醇脫水，包埋，蠟塊在室溫下自然冷卻凝固；修塊后用石蠟切片機(jī)切片，與標(biāo)本垂直方向連續(xù)切片，厚5 μm，間斷集片，將組織切片粘貼于經(jīng)過10%多聚賴氨酸處理過的載玻片上。貼片，60℃烘烤60 min，在切片組織上滴加按1∶1000 比例配制的CaSR 抗體，4℃過夜，檢測。

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-q-PCR）檢測脂肪組織CaSR mRNA 的表達(dá)量 取冰凍組織在研缽中用液氮研磨成為粉末狀小顆粒，并將研磨好的組織轉(zhuǎn)入l.5 mL 離心管中，全程冰上操作，按照Trizol 試劑盒提取脂肪組織中總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物由哈爾濱賽拓生物有限公司設(shè)計(jì)合成，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量PCR 儀上測定。

2.2.6 蛋白印跡法（Western blot）檢測脂肪組織CaSR 蛋白表達(dá)水平及蛋白激酶（AKT）活性 取凍存的脂肪組織在研缽中用液氮研磨成粉末狀小顆粒，加入蛋白裂解液提取蛋白；電泳分離；將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉1 h，用TBST 清洗3 次，每次5 min，加入相應(yīng)的一抗（1∶1000）4℃過夜；加入稀釋好的二抗（1∶1000），室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次（5 min/次），采用化學(xué)發(fā)光顯影觀察結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

空白組大鼠皮毛有光澤，活動敏捷，攝食量及攝水量均無明顯變化，體質(zhì)量增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組大鼠皮毛無光澤，精神萎靡，靈敏性下降，行動緩慢、攝水量及尿量增加，第6 周和8 周時(shí)，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05），見圖1A。

3.2 各組大鼠FBG、FINS、ISI

由圖1B、C 可見，模型組大鼠FBG 水平隨著灌胃脂肪乳時(shí)間增加而增加，其中第4、6、8周時(shí)，與相應(yīng)空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；FINS 表達(dá)水平隨著造模時(shí)間延長而增加，到第8 周時(shí)，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；由圖1D 可見，與空白組比較，模型組大鼠ISI 在第6周、第8 周時(shí)與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 大鼠體質(zhì)量（A）、空腹血糖（B）、空腹胰島素（C）、胰島素敏感指數(shù)（D）的變化Fig 1 Change of body mass （A） and expression level of fasting blood glucose（B） ，fasting insulin（C） ，and insulin sensitivity index（D）in rats

3.3 脂肪組織中CaSR 免疫組化檢測

第2 周時(shí)，空白組與模型組大鼠脂肪組織中均可見CaSR 表達(dá)（棕色），與空白組比較，模型組脂肪組織內(nèi)CaSR 表達(dá)水平下降，見圖2。

圖2 第2 周時(shí)空白組（A）與模型組（B）大鼠脂肪組織中CaSR的表達(dá)水平Fig 2 Expression level of CaSR in adipose tissue of the control group（A）and the model group（B）at the second week

3.4 CaSR 在脂肪組織中mRNA 的表達(dá)

如圖3所示，在脂肪組織中，與空白組比較，模型組CaSR mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，且隨著脂肪乳灌胃時(shí)間的增加而呈下降趨勢，在第6 周、第8 周兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 脂肪組織CaSR mRNA 的表達(dá)Fig 3 Expression level of CaSR mRNA in adipose tissue

3.5 大鼠脂肪組織中CaSR 的蛋白表達(dá)水平

如圖4A 所示，在脂肪組織中，各模型組CaSR 蛋白表達(dá)隨著脂肪乳灌胃時(shí)間的增加而呈下降趨勢，與第2 周時(shí)比較，第8 周時(shí)CaSR 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

3.6 大鼠脂肪組織中AKT 活性

如圖4B 所示，在脂肪組織中，各模型組AKT活性隨著灌胃脂肪乳時(shí)間的增加而呈下降趨勢，與第2 周時(shí)模型組比較，第8 周時(shí)的磷酸化AKT（T308）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與第2 周時(shí)比較，第6 周、第8 周的模型組磷酸化AKT（S473）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 模型組大鼠脂肪組織CaSR 蛋白的表達(dá)（A）及AKT 活性（B）Fig 4 Expression level of CaSR protein （A）and AKT activity （B）in adipose tissue of the model group

4 討論

本研究為模擬高脂飲食對人類健康的影響，采用分周給予大鼠脂肪乳，與空白組比較，第8周時(shí)模型組大鼠體質(zhì)量、FINS、FBG 和ISI 存在顯著差異，提示第8 周時(shí)大鼠產(chǎn)生IR。

Li 等[10]研究表明，AKT 的活性被NPS2390（CaSR 抑制劑）抑制，而GdCl3（CaSR 激動劑）能增強(qiáng)AKT 活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CaSR 的生理效應(yīng)與PI3K/AKT 信號通路密切相關(guān)。研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟和肌肉中，可能通過抑制CaSR，降低PI3K/AKT 信號通路中AKT 活性，導(dǎo)致IR[11]。劉笑男等[12]研究表明，CaSR 可在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，GdCl3可增加AKT 活性，當(dāng)調(diào)節(jié)CaSR 分子表達(dá)水平時(shí)，可增強(qiáng)AKT 活性，改善IR。研究提示，IR 時(shí)CaSR 可能參與PI3K/AKT信號通路。

IR 是指身體目標(biāo)器官或組織對胰島素的敏感性喪失和胰島素?zé)o法促進(jìn)葡萄糖吸收，脂肪量增加通常會引起胰島素抵抗，這是與肥胖有關(guān)的代謝性疾?。ㄈ绱x綜合征和T2DM）的關(guān)鍵因素[13]。CaSR 在人脂肪細(xì)胞中激活，可使促炎細(xì)胞因子白介素6（IL-6），趨化因子C-C 基序配體2（CCL2），白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)升高[14]。此外，CaSR 活化可刺激脂肪細(xì)胞的增殖和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，促使內(nèi)臟脂肪生成增加[15-16]。在本研究中，采用免疫組化法檢測IR 大鼠脂肪組織中CaSR 表達(dá)水平顯著降低；采用RT-qPCR 檢測到高脂飲食誘導(dǎo)IR大鼠的脂肪組織中CaSR mRNA 表達(dá)顯著降低；Western blot 結(jié)果表明，給予脂肪乳2、4、6、8 周后CaSR 蛋白表達(dá)量顯著降低；在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠IR 過程中，CaSR 從基因到蛋白水平均呈現(xiàn)降低趨勢，且與血糖及胰島素水平呈負(fù)相關(guān)，推測CaSR 可能在IR 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

PI3K/AKT 信號通路在細(xì)胞生存過程中發(fā)揮重要作用，如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和生長等。AKT 主要表達(dá)在骨骼肌，脂肪和肝臟等胰島素敏感組織中[17-18]。AKT通過兩個(gè)關(guān)鍵的磷酸化過程激活，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）將激酶結(jié)構(gòu)域中的蘇氨酸308（T308）磷酸化，啟動激活過程，隨后通過mTOR 復(fù)合物2（mTORC2）在羧基末端調(diào)節(jié)域中的絲氨酸473（S473）進(jìn)行磷酸化，完全激活A(yù)KT[19-21]。AKT 還參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中胰島素的調(diào)節(jié)。在高脂飲食喂養(yǎng)第2、4、6 和8 周后，模型組中磷酸化AKT（T308和S473）顯著降低，提示高脂飲食誘導(dǎo)的IR 中PI3K/AKT 信號通路受到抑制。

5 結(jié)論

本研究證明了CaSR 在大鼠脂肪組織中的表達(dá)，脂肪乳誘導(dǎo)的IR 大鼠中，CaSR 分子表達(dá)水平被抑制，可能導(dǎo)致PI3K/AKT 信號通路中AKT活性被抑制，提示CaSR 可能經(jīng)由PI3K/AKT 信號通路，參與高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠IR 發(fā)展過程。因此，CaSR 可作為IR 治療新的靶點(diǎn)，為研究IR發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制提供新的方向。