羥基蒽醌衍生物標(biāo)簽的制備與肉類變質(zhì)監(jiān)測性能研究

王永樂，陳光宇，胡婧雯，倪忠斌，施冬健，陳明清

（江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

隨著國民經(jīng)濟的快速發(fā)展，我國已成為肉類生產(chǎn)和消費大國[1]。肉類在儲存和運輸過程中如處置不當(dāng)易造成腐敗變質(zhì)，流入市場會給消費者的身體健康帶來極大的危險。微生物的活動使肉類發(fā)生降解，產(chǎn)生揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Base Nitrogen，TVB-N）[2-3]，該指標(biāo)的定量檢測需要較為復(fù)雜的步驟[4]。為簡化檢測步驟，研究人員開發(fā)了一系列檢測方法，如電化學(xué)傳感[5-6]、熒光傳感[7-8]以及比色傳感[9-11]等，其中比色傳感相較于前幾種方法具有簡便、直觀等優(yōu)勢。

肉類變質(zhì)過程中產(chǎn)生的TVB-N，會將周圍環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性環(huán)境[12]，將pH響應(yīng)分子摻入包裝膜中或制成智能標(biāo)簽，理論上能夠監(jiān)測肉類變質(zhì)。Aghaei等將茜素添加到醋酸纖維素的丙酮溶液中，通過靜電紡絲成膜，在4℃環(huán)境下能夠有效監(jiān)測肉類變質(zhì)[13]。何華鵬等選用溴甲酚紫和溴百里香酚藍(lán)作為指示劑制成智能標(biāo)簽，能夠監(jiān)測青魚的變質(zhì)[14]。但目前的研究大多未提及指示劑的遷移量，該性能對于肉類包裝材料的安全性至關(guān)重要。

羥基蒽醌衍生物在環(huán)境由中性到堿性轉(zhuǎn)變時其顏色由黃色變?yōu)樽仙?，為pH比色響應(yīng)標(biāo)簽監(jiān)測肉類變質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)[15]。作者探究蒽醌衍生物的不同取代基與羥基蒽醌對TVB-N類靈敏度的關(guān)系，將羥基蒽醌衍生物均勻涂覆在濾紙上，使其表面覆蓋一層醋酸纖維素膜，降低了小分子的遷移，對肉類變質(zhì)產(chǎn)生的TVB-N有較好響應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水AlCl3、苯三酸酐、丁二胺：購自阿拉丁試劑有限公司；4-甲基苯酐：購自麥克林試劑有限公司；1，4-二 羥 基 蒽 醌 （1，4-dihydroxy anthraquinone，DQ）、對苯二酚、氯化鈉、丙酮等試劑：購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；豬肉和青蝦：市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS50型傅立葉紅外變換光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；UV1902-Ⅱ型UV-Vis分光光度計：上海奧析科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AVANCEⅢHD 400型核磁共振譜儀：瑞士布魯克公司產(chǎn)品；SR-60型色差計：深圳市三恩時科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同取代基羥基蒽醌的合成分別使用苯三酸酐、4-甲基苯酐與對苯二酚通過Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)制備得到1，4-二羥基-6-羧基蒽醌（DCQ）和1，4-二羥基-6-甲基蒽醌（BMQ）；反應(yīng)條件為170℃油浴加熱，反應(yīng)時間6 h，反應(yīng)結(jié)束后，在熱鹽酸溶液中抽濾除去未反應(yīng)的苯三酸酐和4-甲基苯酐；再利用羥基蒽醌溶于堿性水溶液的特性進(jìn)一步過濾提純。

1.3.2 不同取代基羥基蒽醌的pH響應(yīng)性分別配制0.1 mol/L磷酸緩沖溶液，其中pH緩沖范圍6~9的為Na2HPO4、NaH2PO4二元緩沖體系，pH緩沖范圍為10~12的為Na2HPO4、NaOH二元緩沖體系，記錄下3種羥基蒽醌衍生物在不同pH緩沖溶液中的顏色，使用UV-Vis分光光度計表征可見光區(qū)吸收光譜的變化，并計算3種羥基蒽醌衍生物在pH為6和12時的最大吸收峰位移。

1.3.3 pH響應(yīng)標(biāo)簽的制備取20 mg的DQ、DCQ和DMQ，溶于20 mL丙酮溶液中，將定性濾紙裁剪成4 cm×2 cm的濾紙片，用鑷子將濾紙片放入上述溶液中10 s，充分浸潤后取出晾干，再分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%的醋酸纖維素（Cellulose acetate，CA）的丙酮溶液，將晾干后的標(biāo)簽用鑷子放入CA的丙酮溶液中，5 s后取出晾干，制備得到表面CA包覆的pH比色響應(yīng)標(biāo)簽。

圖1 羥基蒽醌衍生物和pH比色響應(yīng)標(biāo)簽的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of hydroxyanthraquinone derivatives and pH colorimetric responsive labels

1.3.4 不同響應(yīng)分子制成的標(biāo)簽對丁二胺響應(yīng)靈敏度的測試分別準(zhǔn)備裝有質(zhì)量濃度為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L丁二胺的密閉燒杯，使用上述3種帶有響應(yīng)分子的濾紙置于燒杯10 min后，用色差計測定負(fù)載有羥基蒽醌濾紙響應(yīng)前后的顏色數(shù)據(jù)，并按照公式（1）計算色差值ΔE：

式中：L表示待測物體的明亮度，理論值為0~100，值越大表示物體越白；a表示物體的紅綠度，正值為紅，負(fù)值為綠；b表示物體的黃藍(lán)度，正值為黃，負(fù)值為藍(lán)；均由色差計直接讀取，色差計使用D65光源。L2，a2，b2是響應(yīng)后的數(shù)據(jù)，L1，a1，b1是響應(yīng)前的數(shù)據(jù)。

1.3.5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)醋酸纖維素包覆下標(biāo)簽的響應(yīng)分子遷移量取未包覆大分子和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%，4%，6%的CA/丙酮溶液中包覆的pH響應(yīng)標(biāo)簽烘干后，置于30 mL去離子水中12 h，之后加入0.12 g的NaOH，測定溶液于563 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度和1，4-二羥基-6-羧基蒽醌的濃度和吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算1，4-二羥基-6-羧基蒽醌的遷移量。

1.3.6 不同肉類在室溫下TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)測量從超市購買當(dāng)天屠宰的豬肉和解凍青蝦，其中青蝦去殼去頭處理；根據(jù)GB/T—5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的微量擴散法測定豬肉和蝦肉在室溫下放置不同時間后的TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]。

1.3.7 不同肉類腐敗的檢測將在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CA溶液中浸潤過的pH響應(yīng)標(biāo)簽分別置于裝有20 g豬肉表面皿中，使用保鮮膜密封，放置在室溫（25℃）下，每隔12 h記錄pH響應(yīng)標(biāo)簽的色差變化和數(shù)碼照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種羥基蒽醌分子的結(jié)構(gòu)分析

對3種響應(yīng)分子進(jìn)行FT-IR分析，結(jié)果如圖2（a）所 示。DCQ相 較 于DQ，DMQ在1 693 cm-1附近多了一個羰基的特征峰，此為羧基上的羰基，DMQ相較于DQ，DCQ在1 338 cm-1和1 236 cm-1附近多了甲基的特征吸收峰。在1 630 cm-1附近處為羰基的特征吸收峰。如圖2（b）所示，3種響應(yīng)分子的1H-NMR譜圖，其酚羥基特征峰均出現(xiàn)在化學(xué)位移為12.0~12.5附近，這是由于α位的酚羥基（與羰基相近的酚羥基為α位酚羥基，遠(yuǎn)離羰基的羥基為β位酚羥基）與羰基形成了分子內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致化學(xué)位移向低場移動；DCQ分子上羧基的強吸電子效應(yīng)也導(dǎo)致苯環(huán)上的氫原子化學(xué)位移整體向低場移動。由于DMQ分子的甲基特征峰位置與DMSO的溶劑峰位置重疊，換用氘代氯仿作為溶劑，在化學(xué)位移為2.5附近出現(xiàn)了甲基的特征峰。3種物質(zhì)的1H-NMR譜圖結(jié)果與預(yù)測相符合。綜上所述，DCQ和DMQ成功合成。

圖2 3種羥基蒽醌衍生物的紅外光譜、核磁譜Fig.2 FT-IR spectra and NMR spectra of three hydroxyanthraquinone derivatives

2.2 3種羥基蒽醌分子的pH響應(yīng)性能

羥基蒽醌遇堿變色的機理如圖3（a）所示，酚羥基遇氫氧根脫去質(zhì)子，發(fā)生電子轉(zhuǎn)移使羥基蒽醌結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，顏色加深，其中質(zhì)子離去難易程度決定了羥基蒽醌的變色域，羧基是吸電子基團，能夠降低苯環(huán)上電子云密度，使得質(zhì)子更易離去，甲基是給電子基團，能夠提高苯環(huán)上電子云密度，使質(zhì)子更難離去[17]。3種pH響應(yīng)分子均為羥基蒽醌的衍生物，因此均具有pH響應(yīng)性，在堿性環(huán)境中會變?yōu)樽仙?，但是由于取代基的不同，其變色域會產(chǎn)生細(xì)微的差異。為了探究蒽醌骨架6號碳上取代基的誘導(dǎo)效應(yīng)對pH變色域的影響，將DQ，DCQ，DMQ分別溶于不同pH緩沖溶液之后，記錄三者顏色變化差異。如圖3（b）所示，DQ的pH變色域為pH 9~11，DCQ的pH變色域為pH 8~10，DMQ的pH變色域為pH 10~12。上述結(jié)果表明，蒽醌骨架6號位碳上取代基的誘導(dǎo)會對pH變色域產(chǎn)生影響，吸電子基團導(dǎo)致pH變色域降低，給電子基團導(dǎo)致pH變色域升高。

為進(jìn)一步探究取代基與羥基蒽醌對pH的顏色響應(yīng)關(guān)系，使用UV-Vis分光光度計對3種響應(yīng)分子在不同pH緩沖溶液中的吸收光譜進(jìn)行表征，記錄可見光區(qū)的吸光度與波長關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。3種響應(yīng)分子的最大吸收峰均隨著pH增高而逐漸紅移，顏色也逐漸從黃色變?yōu)樽仙?種響應(yīng)分子的Δλ分別記為Δλ1，Δλ2，Δλ3，其中Δλ1=81 nm，Δλ2=97 nm，Δλ3=84 nm，其中DCQ的Δλ是最大的。綜上所述，DCQ對于pH響應(yīng)變化較早，對于堿性環(huán)境的變化更為敏感。

圖3 羥基蒽醌衍生物的變色機理和pH響應(yīng)性能Fig.3 Color change mechanism and pH responsive performance of hydroxyanthraquinone derivatives

圖4 羥基蒽醌衍生物在不同pH的緩沖溶液中的UV-Vis光譜Fig.4 UV-Vis spectra of three hydroxyanthraquinone derivatives in different pH buffer solutions

2.3 pH響應(yīng)標(biāo)簽性能分析

2.3.1 不同羥基蒽醌衍生物對丁二胺響應(yīng)靈敏度為進(jìn)一步探究不同取代基與羥基蒽醌對丁二胺響應(yīng)的關(guān)系，制備未包覆醋酸纖維素的pH響應(yīng)標(biāo)簽，用色差計記錄不同質(zhì)量濃度的丁二胺響應(yīng)前后的色差值ΔE。結(jié)果如圖5所示，可以看到隨著丁二胺質(zhì)量濃度的升高，3種響應(yīng)分子制備的pH響應(yīng)標(biāo)簽色差均出現(xiàn)了變化，但是色差變化趨勢與pH變化趨勢類似，DCQ色差最大，DQ次之，DMQ最低；表明蒽醌骨架上取代基的誘導(dǎo)效應(yīng)會影響羥基蒽醌對丁二胺響應(yīng)變色靈敏度，吸電子基團會使靈敏度提高，給電子基團使靈敏度降低。

圖5 羥基蒽醌衍生物制成的pH響應(yīng)標(biāo)簽響應(yīng)前后色差值與丁二胺質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.5 Color difference of pH-responsive labels made by hydroxyanthraquinone derivatives before and after response in different concentration of butanediamine

2.3.2 不同醋酸纖維素包覆量的pH響應(yīng)標(biāo)簽在水溶液中的響應(yīng)分子遷移量0.1 mol/L的NaOH溶液中1，4-二羥基-6-羧基蒽醌在563 nm處的吸光度值和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算公式為：

式中y為吸光度值，x為1，4-二羥基-6-羧基蒽醌在NaOH溶液中的質(zhì)量濃度，單位是mg/L，據(jù)此計算單個標(biāo)簽在水溶液中的遷移量。

為了降低響應(yīng)分子的遷移量，分別采用CA對制備的pH響應(yīng)標(biāo)簽進(jìn)行包覆，并測量其在水溶液中的遷移量，結(jié)果表1所示，可以看到隨著醋酸纖維素的增加，遷移量逐漸下降；對于采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% CA包覆的pH響應(yīng)標(biāo)簽，和未包覆的對照組相比，其遷移量下降了40.6%，故此方法能一定程度上防止1，4-二羥基-6-羧基蒽醌遷移到標(biāo)簽外。

表1 包覆CA后標(biāo)簽中羥基蒽醌衍生物的遷移量Table 1 Mobility of hydroxyanthraquinone derivatives in labels coated with CA

2.3.3 不同醋酸纖維素包覆量的pH響應(yīng)標(biāo)簽在不同丁二胺濃度下顏色變化使用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的醋酸溶液浸潤pH比色響應(yīng)標(biāo)簽，會使包覆在標(biāo)簽上的CA的量產(chǎn)生影響，一般來說，CA質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，包覆在標(biāo)簽上的CA的量也越多。對包覆了CA的pH比色響應(yīng)標(biāo)簽進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的丁二胺響應(yīng)測試，結(jié)果如圖6所示。隨著CA包覆量的提升，響應(yīng)靈敏度和最大色差值均出現(xiàn)了一定程度的降低，可能是由于包覆的CA在一定程度上隔絕了氣體進(jìn)入標(biāo)簽內(nèi)部，從而減少響應(yīng)分子和丁二胺的接觸。

圖6 包覆CA的pH響應(yīng)標(biāo)簽色差與丁二胺質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.6 Relationship between the color difference of pH responsive labels coated with CA and the concentration of butanediamine

2.4 不同肉類在室溫下的新鮮度檢測

根據(jù)GB 2707—2016和GB 2733—2015中對畜禽肉和水產(chǎn)品中TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)要求（豬肉中TVB-N低于15 mg/hg，蝦肉中TVB-N低于20 mg/hg為新鮮）[18-19]。使用半微量擴散法對肉類中的TVB-N進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示。在25℃條件下，TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間增加逐漸增加。將浸泡在不同濃度的CA溶液中的pH響應(yīng)標(biāo)簽晾干后置于盛有不同肉類的表面皿內(nèi)，每隔12 h記錄下pH響應(yīng)標(biāo)簽的色差和數(shù)碼照片，數(shù)碼照片如圖8所示。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CA/丙酮溶液會導(dǎo)致濾紙表面覆蓋不同量的CA，其中在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的CA/丙酮溶液中，標(biāo)簽產(chǎn)生了發(fā)白的現(xiàn)象，這是由于標(biāo)簽表面粗糙和CA含量過多使透明性下降。結(jié)果導(dǎo)致其在豬肉發(fā)生變質(zhì)時，標(biāo)簽的顏色變化較未覆蓋CA的對照組更明顯。在蝦肉的監(jiān)測中，標(biāo)簽直到36 h左右才發(fā)生了肉眼可辨的變化，而此時蝦肉中TVB-N含量已超過國家標(biāo)準(zhǔn)，因此該標(biāo)簽不適用于蝦肉的監(jiān)測，其原因可能是由于淡水魚蝦肌蛋白含量較豬肉更高，在腐敗初期降解產(chǎn)生大量乳酸和磷酸，pH會出現(xiàn)先降低后上升的情況[20]，干擾了標(biāo)簽對于堿性的TVB-N的響應(yīng)，導(dǎo)致不能及時變色。而豬肉中肌蛋白含量少于淡水魚蝦，因此pH呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢[21]，故該標(biāo)簽適用于豬肉的變質(zhì)監(jiān)測。

圖7 25℃下豬肉和蝦肉中TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化Fig.7 Variation of TVB-N content in pork and shrimp meat with time at 25℃

圖8 25℃下浸潤不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CA溶液的標(biāo)簽在裝有豬肉的表面皿中隨時間變化的照片F(xiàn)ig.8 Observation of the labels immersed in the CA solution under different concentrations at 25℃ inpetri dish with pork

3 結(jié)語

作者基于羥基蒽醌衍生物的pH響應(yīng)性，合成羥基蒽醌衍生物，并且通過對比數(shù)種羥基蒽醌衍生物的pH響應(yīng)性能，發(fā)現(xiàn)羧基的引入能使羥基蒽醌對于堿性環(huán)境更敏感，而甲基的引入會降低敏感性，這可能與取代基的誘導(dǎo)效應(yīng)有關(guān)，羥基蒽醌這一特性可為以后該領(lǐng)域的研究提供參考。將1，4-二羥基-6-羧基蒽醌與濾紙相結(jié)合，制備得到pH比色響應(yīng)標(biāo)簽，并進(jìn)一步使用CA包覆在其表面，以提高pH比色響應(yīng)標(biāo)簽的安全性。實驗結(jié)果表明：該標(biāo)簽顏色會隨著肉類的腐敗變質(zhì)呈現(xiàn)出不同的變化，標(biāo)簽的顏色可快捷反映肉類的品質(zhì)，判斷肉類是否可食用。