漢族、藏族胃癌患者胃癌組織中轉化生長因子β誘導基因的表達及其臨床意義△

鄧偉，蘆永福，王學紅

1青海大學附屬醫(yī)院消化內科，西寧 810001

2成都大學附屬醫(yī)院消化內科，成都 610000

盡管近年來手術治療、放化療和免疫治療等方法不斷發(fā)展，但胃癌（gastric cancer，GC）仍是全球惡性腫瘤死亡的第二大原因，全球每年新發(fā)GC 病例約120 萬例，而中國每年新發(fā)GC 病例達41 萬例，每年死亡病例約為30 萬例。全球GC 的流行病學存在極大的地理差異和人群分布差異，韓國、日本、中國等東亞國家GC 發(fā)病率和病死率明顯高于北美、西歐及非洲地區(qū)的國家。青海地處青藏高原，自然條件差，經濟滯后，是中國GC 的高發(fā)區(qū)之一，GC 的檢出率高達8.49%，同時青海是一個多民族聚居的省份，研究表明GC 在不同民族間的檢出率存在明顯差異，藏族GC 檢出率（6.13%）高于漢族（5.96%），但具體機制不明。轉化生長因子β誘導基因（transforming growth factor β induced gene，TGFBI）在不同腫瘤微環(huán)境中與整合素結合而發(fā)揮促進或抑制腫瘤的作用，但具體機制尚待進一步研究。TGFBI 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，而目前國內外關于TGFBI 在GC 中具體作用的研究較少且仍存在爭議，此外尚未查到TGFBI 在不同民族間表達情況的相關文獻。因此，本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測漢族、藏族患者GC 組織、癌旁組織、慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）和慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis，CNAG）組織中

TGFBI

的表達情況，探討其在早期檢測及診斷GC 中的價值，了解其在兩個民族間的表達是否具有差異性，為揭示GC 高發(fā)及漢族、藏族GC 檢出率差異的可能原因積累資料，為進一步探討不同民族GC 高發(fā)的原因及GC 預防、早期診治和預后判斷提供一定的參考依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017 年11 月至2018 年11 月于青海大學附屬醫(yī)院經胃鏡檢查及病理活檢確診的60 例GC患者（漢族30 例，藏族30 例）、60 例CAG 患者（漢族30 例，藏族30 例）及60 例CNAG 患者（漢族30例，藏族30 例）。納入標準：①年齡為18～80 歲，性別不限；②長期（＞20 年）生活于青海的漢族或藏族居民；③經胃鏡檢查及病理活檢確診為GC、CAG 或CNAG。排除標準：①具有其他惡性腫瘤病史；②合并消化性潰瘍、胃腸穿孔、消化道大出血等；③正在服用阿司匹林、華法林等抗凝藥物或存在凝血功能障礙；④近1 個月接受過質子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）、抑酸藥和保護胃黏膜的藥物治療；⑤近1 個月進行過抗幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）治療；⑥合并肝功能衰竭、心力衰竭、腎功能衰竭；⑦合并嚴重的神經病變或精神疾??；⑧接受過放療或化療；⑨妊娠期；⑩酒精依賴。收集漢族GC 組織及其癌旁組織（距離腫瘤＞5 cm 的組織）、藏族GC 組織及其癌旁組織、漢族CAG 組織、藏族CAG 組織、漢族CNAG 組織、藏族CNAG 組織各30 例。本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

4S Red Plus 核酸染色劑（10 000×水溶液）購自加拿大BBI 公司，Maxima Reverse Transcriptase 及GeneRuler DNA Ladder Mix 均購自美國Thermo Scientific 公司，SMA4000 微量分光光度計購自美林恒通（北京）儀器有限公司，LightCycler480 Ⅱ型熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自瑞士Roche 公司，UNIQ-10 柱式Trizol總RNA 抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 RNA 提取及RT-PCR

嚴格按照Trizol 試劑盒提取各組織中的RNA，采用SMA4000 微量分光光度計檢測各組織中總RNA 濃度與純度，采用瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA的完整性。根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，PCR 反應條件：94 ℃3 min；94 ℃5 s，57 ℃15 s，72 ℃30 s，共45 個循環(huán)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因。

GAPDH

正向引物5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，反 向 引 物5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；

TGFBI

正向引物5'-GGGACATGCTCACTATCAACG-3'，反向引物5'-TGGCTGAGTCTGGGATGAGTA-3'。每個樣本重復測3 次，取平均值為Ct 值。采用2法計算

TGFBI

mRNA 相對表達量。

1.4 觀察指標

分析漢族、藏族患者不同胃黏膜組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量，比較漢族、藏族間同一類型胃黏膜組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量，比較不同臨床特征GC 患者GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析，非正態(tài)分布的計量資料以中位數（四分位數）[

M

（

P

，

P

）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney

U

檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis

H

檢驗，多組間兩兩比較采用Nemenyi 檢驗。以

P

＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢族不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較

漢族GC 組織、癌旁組織、CAG 組織及CNAG組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（

H

=35.765，

P

＜0.01）；GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于癌旁組織、CAG 組織、CNAG 組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于CNAG 組織，差異有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織和CAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）；CAG 組織和CNAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。（表1）

表1 漢族不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較[M（P25，P75）]

2.2 藏族不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較

藏族GC 組織、癌旁組織、CAG 組織及CNAG組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（

H

=35.494，

P

＜0.01）；GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于癌旁組織、CAG 組織、CNAG 組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于CNAG 組織，差異有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織和CAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）；CAG 組織和CNAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 藏族不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較[M（P25，P75）]

2.3 漢族、藏族間同一類型胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較

漢族、藏族間同一類型胃黏膜組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表3）

表3 漢族、藏族間同一類型胃黏膜組織中TGFBI mRNA的相對表達量[M（P25，P75）]

2.4 不區(qū)分民族的情況下不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較

不區(qū)分民族的情況下，GC 組織、癌旁組織、CAG 組織及CNAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（

H

=70.623，

P

＜0.01）；GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于癌旁組織、CAG 組織、CNAG 組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織和CAG 組織中

TGFBI

mRNA相對表達量均高于CNAG 組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織和CAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。（表4）

表4 不區(qū)分民族的情況下不同胃黏膜組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較[M（P25，P75）]

2.5 不同臨床特征GC 患者GC 組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度及遠處轉移情況的GC 患者GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。浸潤深度為T～T、有淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期的GC 患者GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量分別高于浸潤深度為T～T、無淋巴結轉移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的GC 患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表5）

表5 不同臨床特征GC 患者GC 組織中TGFBI mRNA 相對表達量的比較（n=60）

3 討論

GC 的發(fā)病率較高，其早期常無明顯癥狀，缺乏有效的早期診斷方法，確診時往往處于晚期，因此成為全球發(fā)病率和病死率最高的腫瘤之一。自從Skonier 等發(fā)現TGFBI 后，其研究不斷深入，目前認為TGFBI 可能通過多種通路和自身途徑參與調節(jié)細胞黏附、遷移、增殖、凋亡及炎性反應，從而發(fā)揮促癌或抑癌作用。

本研究檢測了漢族、藏族不同胃黏膜組織中

TGFBI

mRNA 的表達情況，結果顯示漢族GC 組織、癌旁組織、CAG 組織及CNAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量逐漸降低，GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于癌旁組織、CAG 組織、CNAG 組織，癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于CNAG 組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；癌旁組織和CAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。同時在藏族胃黏膜組織中及不分民族的情況下也得到了相似的結果，與Han 等采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測GC 患者血清中TGFBI 呈高表達的結果一致，與尹青香的研究結果有不同之處。提示TGFBI 與GC的發(fā)生密切相關，但尚需加大樣本量進一步研究。癌旁組織與GC 組織同處于一個內外環(huán)境中，癌旁組織常常被認為是腫瘤易發(fā)組織。本研究結果顯示，在漢族、藏族或不分民族的情況下，癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量均介于GC 組織與CNAG 組織之間，提示癌旁組織處于GC 和CNAG 的中間狀態(tài)，因此推斷TGFBI 逐漸累積到一定水平可導致GC 的發(fā)生，動態(tài)監(jiān)測TGFBI 可能有助于GC 的早期篩查。雖然癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于CAG 組織，但差異無統計學意義（

P

＞0.05）?？赡艿脑蛉缦拢孩贅颖玖刻?，尚需加大樣本量進一步研究；②CAG 作為一種癌前疾病，其基因層面已發(fā)生改變，改變后的CAG與腫瘤易發(fā)組織無太大差異，但仍需進一步研究。漢族、藏族間同一類型胃黏膜組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05），提示漢族、藏族間的TGFBI 表達無明顯差異，TGFBI 可能不是兩個民族間GC 檢出率不同的原因，漢族、藏族間GC 檢出率不同可能與漢族、藏族不同的生活飲食習慣有關，其次本研究并未進行基因測序，基因多態(tài)性是否為導致漢族、藏族間GC 檢出率不同的原因尚待進一步研究，這也是接下來研究的新方向。本研究進一步比較了不同臨床特征GC 患者GC組織中

TGFBI

mRNA相對表達量，結果顯示，浸潤深度為T～T的GC患者GC組織中

TGFBI

mRNA相對表達量高于浸潤深度為T～T的患者（

P

＜0.05），與Li 等研究中TGFBI 高表達與GC 腹膜轉移密切相關的結果相似，提示TGFBI 參與GC 腹膜轉移。GC 腹膜轉移的關鍵在于腫瘤細胞附著到腹膜，TGFBI 有助于成纖維細胞的黏附和擴展，成纖維細胞可通過膜上的糖蛋白與腫瘤細胞進行選擇性黏附。本研究結果顯示，有淋巴結轉移的GC患者GC組織中

TGFBI

mRNA相對表達量高于無淋巴結轉移的患者，與Li等研究中TGFBI 在淋巴結轉移陽性的GC患者中表達升高的結果相似。與之相反，Holmberg 等研究指出轉化生長因子β誘導蛋白通過激活p42/44激酶抑制胰島素樣生長因子2刺激的腫瘤相關肌成纖維細胞的增殖和遷移，從而減慢GC細胞生長和GC進展。因此，TGFBI表達與淋巴結轉移有關，但在GC 患者同一種腫瘤內環(huán)境中TGFBI是否扮演著不同的作用，尚待加大樣本量研究。TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期的GC 患者GC 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（

P

＜0.05），與Ma等研究結果相似，可能的原因是TGFBI 通過激活整合素ανβ5-Src 信號通路誘導血管內皮鈣黏蛋白分離，從而導致血管內皮滲透性增加，腫瘤細胞外滲有助于腫瘤細胞擴散和轉移，但在GC中是否有著相同的機制尚待研究，因此高表達的TGFBI 可能參與GC 細胞的遷移及侵襲，可用于評估GC預后。綜上所述，漢族、藏族GC 患者間

TGFBI

mRNA 相對表達量無明顯差異，TGFBI 可能不是漢族和藏族間GC 檢出率不同的原因，但本研究僅檢測

TGFBI

mRNA 的表達情況，并未進一步對基因進行測序，基因多態(tài)性是否為導致漢族、藏族間GC 檢出率不同的原因尚待進一步研究。癌旁組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量介于GC 組織與CNAG 組織間，提示TGFBI 逐漸累積到一定水平可導致GC 的發(fā)生，但具體機制仍需進一步研究。此外GC 組織、癌旁組織、CAG 組織、CNAG 組織中

TGFBI

mRNA 相對表達量逐漸下降，且TGFBI 表達情況與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，因此動態(tài)檢測TGFBI 對GC 患者的早期診斷、治療及預后評估具有一定的幫助。